大黄素、黄芪多糖在体外对乙型肝炎病毒的抑制作用临床医学论文

大黄素、黄芪多糖在体外对乙型肝炎病毒的抑制作用_临床医学论文 作者：党双锁　张正国　张欣　宋平　边静　程延安 【摘要】 　　目的 体外观察大黄素、黄芪多糖单用与联合应用抗HBV的作用方法 以HepG2.2.15细胞为研究模型，选用干扰素α、拉米夫定为阳性对照药物，观察培养液中加入不同浓度大黄素、黄芪多糖及两药联合应用抗HBV作用的效果采用Taq man荧光定量PCR检测细胞上清HBV DNA，ELISA检测培养上清液HBsAg、HBeAg水平的变化采用MTT法观察它们对细胞生长的影响结果 大黄素的3个剂量组(12.5、25.0、50.0mg/L)和所观察的时间点(3、6、9d)对HBV DNA、HBsAg、HBeAg表现出剂量与时间依赖的抑制作用(P<0.05)大黄素对HBV DNA抑制的半数抑制浓度为21mg/L，对HepG2.2.15细胞半数细胞毒性浓度为40.66mg/L， 治疗 指数为1.94同时发现黄芪多糖各剂量组对HBV无明显的抑制作用(P>0.05)大黄素、黄芪多糖联合应用在疗效方面无明显的交互作用(P>0.05)结论 大黄素在体外对HBV具有一定的抑制作用，黄芪多糖无明显抑制HBV的作用，两药联用无明显协同抗HBV的作用。

【关键词】 大黄素；黄芪多糖；乙型肝炎病毒；细胞培养　　Inhibition on hepatitis B virus by emodin　and astragalus polysaccharides in vitro　　ABSTRACT: Objective To investigate the effects of emodin, astragalus polysaccharides (APS) on hepatitis B virus (HBV) in vitro. Methods Human hepatoma G2.2.15 cell line stably expressed hepatitis B virus particles in culture. The cells were exposed to different concentrations of emodin, APS, interferon α, and lamivudin, respectively. Realtime PCR was applied to quantify extracellular HBV DNA and ELISA was applied to assess HBsAg and HBeAg. MTT assay was used to evaluate the cytotoxicity of drugs. Results The results showed that exposure of HepG2.2.15 cells to emodin resulted in a time and concentrationdependent inhibition of HBV DNA replication and HBsAg, HBeAg secretion (P<0.05). IC50 to HBV DNA was 21mg/L, CC50 to HepG2.2.15 cells was 40.66mg/L, and the treatment index (TI) was 1.94. APS could not restrain HBV DNA, HBsAg and HBeAg obviously in vitro (P>0.05). The interaction was not significant between emodin and APS (P>0.05). Conclusion Emodin had time and concentrationdependent inhibitory effects to HBV in vitro in some extent; APS could not inhibit HBV obviously in vitro; Coadministration of emodin and APS had not significant interaction in restraining HBV in vitro.　　KEY WORDS: emodin; astragalus polysaccharides; hepatitis B virus; cell culture　　病毒性乙型肝炎的治疗关键是抗病毒治疗。

中药在肝病治疗中起着很重要的作用大黄和黄芪是治疗乙肝复方中最常用到的两味中药近年来，研究证明它们对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)有一定的治疗作用大黄素(emodin)是中药大黄的主要有效单体，黄芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)是黄芪的主要有效成分本研究以HepG2.2.15细胞为体外HBV复制模型，初步观察大黄素、黄芪多糖单独及联合应用对HBV的抑制作用　　1 材料与方法 　　1.1 药物 大黄素(纯度950g/L购自西安崇信天然添加剂有限公司，由国家中药鉴定所鉴定，批文号：25100806)，黄芪多糖(纯度为600g/L，西安鸿生生物技术有限公司生产，国家中药鉴定所鉴定，批号：040618)，干扰素α(购自罗氏公司，批号：010801I)，拉米夫定(3TC)0.1mmol/L的母液，由西安 交通 大学药学院提供　　1.2 试剂及主要仪器 噻唑蓝(MTT，Sigma)，二甲基亚砜(DMSO, Sigma)，HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒(上海华泰生物工程公司)，HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)，和PE7700型自动荧光PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。

　　1.3 细胞 HepG2.2.15细胞由第四军医大学唐都 医院 全军感染病诊疗中心惠赠，可稳定表达乙肝病毒蛋白并分泌病毒颗粒培养液为DMEM(Gibco)，含200mL/L胎牛血清(杭州四季青生物材料公司)、0.3g/L谷氨酰胺(Gibco)，1×105u/L青链霉素(华北制药厂)，碳酸氢钠调整pH值到7.2消化细胞用2.5g/L胰蛋白酶(Gibco)　　1.4 细胞培养 2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，每孔200μL，于37℃、50mL/L CO2培养箱培养24h，待细胞贴壁后，换培养液进行实验　　1.5 实验分组 实验共分3大组，17个剂量组，分组如下：阳性对照组分别为干扰素(INFα)、拉米夫定，各设3个剂量组(125000、250000、500000u/L INF α；0.025、0.05、0.1μmol/L 3TC)；实验组为3个组，即大黄素组(12.5、25.0、50.0mg/L)，黄芪多糖组(120、240、480g/L)，联合用药组(25.0mg/L大黄素＋120g/L黄芪多糖，50.0mg/L大黄素＋120g/L黄芪多糖，25.0mg/L大黄素＋240g/L黄芪多糖，50.0mg/L大黄素＋240g/L黄芪多糖)；阴性对照组即生理盐水组，用等体积生理盐水加入。

实验中除阴性对照组设10个复孔外，其余每个剂量组设5个复孔，用含药物培养液进行干预培养每3d换同样浓度含药培养液及对照培养液1次各孔在3、6、9d时，将吸去的上清液置于-20℃冰箱保存待检　　1.6 MTT实验 加药第9天吸去上清，每孔加5g/L的MTT 20μL，37℃培养4h，弃上清后，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，测定570nm吸光度按下列公式 计算 细胞的抑制百分率　　细胞抑制百分率=阴性对照组平均A值-实验组平均A值阴性对照组平均A值×100%按下列公式计算药物的半数细胞毒性浓度(CC50)　　CC50= lg-1B+0.5-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率×C (B=lg<50%药物浓度，C=lg2)　　1.7 荧光定量PCR法检测细胞外HBV DNA[1] 按照达安基因股份有限公司HBV核酸提取与核酸扩增荧光检测试剂盒说明书操作两引物序列分别为P15′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3′，P25′ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3′，荧光探针序列为5′TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG3′。

各反应管放入PE7700自动荧光PCR仪，按下列条件扩增：93℃ 2min预变性，然后93℃ 45s到55℃ 1min循环扩增10个循环，再按93℃ 30s到55℃ 45s循环扩增，共30个循环反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果按照下面公式计算药物对HBV DNA的抑制率　　HBV DNA抑制率=阴性对照组HBV DNA拷贝数-实验组HBV DNA拷贝数阴性对照组HBV DNA拷贝数×100% 按下列公式计算药物的半数抑制浓度(IC50)　　IC50=lg-1B+0.5-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率×C　　(B= lg <50%药物浓度，C=lg 稀释倍数的倒数)　　治疗指数(TI)= CC50/IC50　　1.8 HBsAg和HBeAg的测定 使用双抗体加心ELESA法[1]根据试剂盒说明测定培养上清液的HBsAg和HBeAg，记录P/N值，按照下面公式计算药物对HBV DNA的抑制率　　HBsAg(HBeAg)抑制率=对照组P/N值-药物组P/N值对照组P/N值-2.1×100%　　1.9 统计学处理 计量资料用均数±标准差表示，应用SPSS11.0软件进行方差分析检验，StudentNewmanKeuls进行不同组之间的两两比较。

采用析因分析观察两种药物的交互作用，检验水准α=0.05　　 2 结果 　　2.1 细胞毒性的测定 用药第9天，MTT实验结果显示12.5mg/L大黄素无明显毒性作用，25.0、50.0mg/L大黄素对细胞生长抑制率分别为29.6%、58.67%， 计算 其CC50为40.66mg/L黄芪多糖各组与阴性对照组比较均未见到抑制细胞生长的作用(P>0.05)大黄素与黄芪多糖联用无明显增加细胞毒性的协同作用(P>0.05)各浓度拉米夫丁与较低浓度干扰素α也无明显细胞毒性作用，仅500000u/L干扰素α组抑制率达到48.1%，有统计学差异(P<0.05) 　　2.2 药物对HepG2.2.15细胞培养上清的HBV DNA的抑制作用 药物作用第3天，大黄素25、50mg/L组平均HBV DNA的抑制率分别仅9.69%和35.59%，12.5mg/L组与阴性对照组间无明显差异(P>0.05)作用第6天大黄素的抑制作用逐渐增强作用至第9天，12.5、25、50mg/L大黄素平均HBV DNA的抑制率已经分别达到了21.21%、54.33%和68.65%，与阴性对照组相比，均表现出抑制HBV病毒核酸复制的作用(表1)。

方差分析表明，大黄素对HBV DNA的抑制效果随作用时间延长而增强(P<0.001)，随剂量加大也逐渐增强(P<0.001)，呈明显的作用时间依赖性和剂量依赖性根据公式计算，大黄素IC50为0.21mg/L， 治疗 指数(TI)为1.94　　黄芪多糖不同质量浓度、不同作用时间均与阴性对照组HBV DNA无明显差异(P>0.05)析因分析表明，黄芪多糖与大黄素两种药物联用，对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制的抑制没有明显协同作用(P=0.607)　　干扰素α在体外对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制也具有一定的作用，其I。