详谈戊型肝炎病毒多拷贝分泌表达载体的构建=“news_bd”> 酵母表达系统以其表达产物类似于天然蛋白、能保持很好的生物学活性、表达条件易于控制、易于工业化生产等优势，作为疫苗研制的载体已被成功应用由于胞内表达产物还需细胞破碎，才能进行SDS-PAGE 及下游纯化工作等，步骤较繁琐外源基因的有效分泌表达，不仅有利于表达产物的分离纯化，而且Pichia pastoris 表达系统在分泌外源蛋白过程中利于进行糖基化、二硫键的形成及正确的折叠、翻译后加工等此前我们利用胞内表达载体pAO815 构建了多拷贝转化子，由于表达的目的蛋白在胞内，需首先破碎细胞，在破碎过程中产生的热量容易使蛋白变性因此本实验欲利用重叠PCR技术将α-factor 信号肽基因与目的基因ORF2128 - 660拼接后插入pAO815 载体，将胞内表达载体pAO815 改建成分泌型表达载体α-ORF2128 - 660 /pAO815( 单拷贝) ，再根据pAO815 载体BamHI-BglII同尾酶特点，体外构建2 ( AOX-α-ORF2128 - 660) /pAO815( 2 拷贝) 多拷贝表达盒，比较不同转化子在毕赤酵母中的表达水平，挑选得到蛋白高表达的重组菌株。
材料与方法 1 菌株与质粒 pAO815 载体、毕赤酵母菌GS115、大肠杆菌TOP10F' 购自Invitrogen 公司; pMD-18T simple vector购自TaKaRa 公司含有戊型肝炎病毒ORF2 + 3( E) 的重组质粒为兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室构建 2 主要试剂及培养 基碱性磷酸酶( CIAP) 、Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶( EcoRI，SalI，BglⅡ，BamHI) 、T4 DNA 连接酶、DL 15 000，DL 2 000，1000ladder 相对分子质量标准、蛋白相对分子质量标准等购自TaKaRa 公司;PVDF 膜购自PALL 公司; PCR 产物回收试剂盒、胶回收试剂盒购自QIAGEN; 点突变试剂盒购自STRATAGENE; 质粒提取试剂盒购自北京博大泰克; 抗HEV( 戊型肝炎病毒) 抗体( 属多克隆抗体)为北京病毒所馈赠LB，MD，BMGY，BMMY 培养基的配制参照Invitrogen 公司手册 3 引物设计与合成 根据Genbank 已公布的戊型肝炎病毒ORF2 基因序列，Primer 5. 0 软件设计一对引物扩增ORF2aa128-aa660，由上海生工生物公司合成。
引物序列为: P1: 5'cgg aat tcg ccacc atg ccagtgc ctg atg ttgac3'( 下划线部分为EcoRI 位点，g ccacc 为真核表达Kozark 序列，) ; P2: 5'cgg aat tct act ccc gag ttt taccca cc 3'( 下划线部分为EcoRI 位点) pAO815 载体的分泌改造引物序列为: α 上: 5'-ccg gaa ttc atg aga ttt cct tca att ttt act gct g-3'( 下划线部分为EcoRI 位点) ; α 下: 5'-gag tca aca tca ggc actgga gct tca gcc tct ctt ttc tcg aga gat ac-3'; α-HEV 上:5'-gaa aag aga ggc tga agc tcc agt gcc tga tgt tga ctcccg cgg cgc cat-3'4 目的基因扩增用含有ORF2 + 3( E) 的重组质粒为模板，P1，P2为引物，PCR 扩增目的基因ORF2128 - 660( E) ，反应体系30 μL，反应条件为: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 40 s，55 ℃50 s， 72 ℃ 1 min， 30 个循环; 最后72 ℃延伸5 min。
反应结束后取2 μL PCR 扩增产物用1. 2% 琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果5 重组克隆质粒ORF2128 - 660( E) /pMD-18T 的构建及鉴定采用QIAGEN 公司的PCR 产物回收试剂盒回收纯化ORF2128 - 660( E) 片段，然后用T4 DNA 连接酶将目的基因ORF2128 - 660( E) 与克隆载体pMD-T simplevector 连接，4 ℃ 过夜，转化感受态大肠杆菌TOP10F'，涂布于含氨苄西林( 0. 05 mgmL - 1 ) 的LB平板培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养16 h，挑取单克隆菌落，接种于含氨苄西林( 0. 05 mgmL - 1 ) 的LB 培养基中37 ℃，180 rmin - 1 过夜培养，提取质粒，经PCR 鉴定6 突变质粒ORF2128 - 660 /pMD-18T 的构建及鉴定以ORF2128 - 660( E) /pMD-18T 为模板，Mf，Mr 为引物对目的基因进行突变PCR 完后直接取0. 6 μLDpnI 内切酶加于石蜡层下，吹打混匀，置于37 ℃水浴2 h，然后转化感受态大肠杆菌TOP10F'，涂布于含氨苄西林( 0. 05 mgmL - 1 ) 的LB 平板培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养16 h，挑取单克隆菌落，接种于含氨苄西林( 0. 05 mgmL - 1 ) 的LB 培养基中37 ℃，180 rmin - 1过夜培养，提取质粒，经PCR，Eco-RI 酶切鉴定及送上海生工生物公司测序。
7 信号肽与目的基因拼接的扩增以pPIC9K 质粒做为模板，以α 上、α 下为引物，扩增出α-factor 信号肽基因; 以突变成功的质粒ORF2128 - 660 /pMD-18T 为模板，α-HEV 上、HEV 下为引物，扩增出ORF2128 - 660基因纯化回收上述2 次PCR 产物，以1∶ 1摩尔数混合，加入引物α 上和HEV下采用重叠PCR 方法进行基因拼接[5]8 重组表达质粒α-ORF2128 - 660 /pAO815( 单拷贝)的构建及鉴定EcoRI 分别单酶切pAO815 载体和α-ORF2128 - 660 /PMD-18T 质粒，PCR 产物回收试剂盒回收目的片断α-ORF2128 - 660和线性化的pAO815 载体，然后将回收得到的α-ORF2128 - 660基因与pAO815载体连接、转化，挑取单克隆菌落接种于LB 培养基中， 37 ℃，180 rmin - 1 过夜培养，提取质粒，用HindⅢ酶切鉴定片段插入方向9 2( AOX-α-ORF2128 - 660) /pAO815 ( 2 拷贝) 重组表达质粒的构建及鉴定BamH Ⅰ 和Bgl Ⅱ 双酶切α-ORF2128 - 660 /pAO815，将获得的目的基因表达盒( AOX-α-ORF2128 - 660) 与去磷酸化的α-ORF2128 - 660 /pAO815连接，转化大肠杆菌TOP10F'，挑取单克隆菌落接种于LB 培养基中，37 ℃，180 rmin - 1 过夜培养，提取质粒，BamHI 和BglII 双酶切法鉴定重组质粒。
10 电转化分别抽提单、2 拷贝质粒及空载体质粒，BamHⅠ单酶切线性化后，电击转化至毕赤酵母GS115 菌株中，电转化参数为: 1. 5 KV，25 μF，200 Ω 条件下电转化; 均匀涂布于MD 培养平板; 28 ～ 30 ℃培养直至克隆出现11 重组多拷贝质粒在毕赤酵母中的诱导表达挑取毕赤酵母转化子，接种到BMGY 培养液中， 30 ℃， 230 rmin - 1 振荡培养过夜，离心弃上清，BMMY 培养液悬浮酵母细胞，继续振荡培养24 h，每隔24 h 加入终浓度0. 5% 的甲醇，并分别在24，48，72， 96 h 取酵母细胞悬液，用PBS 调整菌体密度至同一A 值，分别取1 mL，5 000 rmin - 1离心8 min，取沉淀进行液氮-煮沸法破碎酵母蛋白，再次5 000rmin - 1 离心8 min，取上清用10%SDS-PAGE，ELISA法进行目的蛋白检测12 目的蛋白的ELISA 检测取100 μL 细胞上清加入反应孔( 5 μgmL - 1 人抗HEV 抗体包被) 中，每样品平行做2 孔，同时设阴性对照( 空载体表达产物) ，37 ℃反应1 h; PBS 洗涤6 次，拍干; 每反应孔中加入100 μL 1∶ 150 辣根过氧化物标记的人抗HEV 抗体，37 ℃反应1 h; PBS 洗涤6 次，拍干; 加底物A，B 液，每孔各50μL， 37 ℃避光显色10 ～ 15 min; 每孔加终止液50 μL; A450 处测吸光度。
结果 1 目的基因ORF2128 - 660( E) 扩增产物的鉴定 PCR 产物在1. 2% 琼脂糖凝胶上电泳，得到一条约为1 600 bp 目的基因带，其大小与预期一致 2 目的基因ORF2128 - 660( E) 的点突变及鉴定 EcoRI 单酶切ORF2128 - 660( E) /pMD-18T 重组质粒得到一条约2 700 bp 大小的pMD-18T 片段和约300 bp，1 300 bp 的片段，而EcoR I 单酶切ORF2128 - 660 /pMD-18T 重组质粒得到一条约2 700 bp大小的pMD-18T 片段和1 600 bp 目的基因带，表明目的基因点突变成功 3 目的基因的点突变及鉴定 3 信号肽与目的基因拼接( α-ORF2128 - 660) 的扩增产物鉴定泳道1 为信号肽扩增产物，大小为267 bp; 泳道2 为目的基因扩增产物，大小约为1 600 bp; 泳道3为信号肽与目的基因拼接产物( α-ORF2128 - 660) ( 引物: α 上、HEV 下为引物) ，大小约为1 900 bp; 扩增结果与预期的一致。
4 α-factor 与目的基因的拼接4 重组表达 质粒α- ORF2128 - 660 /pAO815 的构建及鉴定在pAO815 载体第873 bp 处有单一HindⅢ位点，HindⅢ位点距目的基因插入位点EcoRI 有70 bp距离，同时在目的基因α-ORF2128 - 660上游第441 bp处有单一Hind Ⅲ 位点，因此重组表达质粒α-ORF2128 - 660 /pAO815 用HindⅢ单酶切鉴定，可见约500 bp 的特异片段，表明目的片段( α-ORF2128 - 660)正方向插入pAO815 载体3 信号肽与目的基因拼接( α-ORF2128 - 660) 的扩增产物鉴定泳道1 为信号肽扩增产物，大小为267 bp; 泳道2 为目的基因扩增产物，大小约为1 600 bp; 泳道3为信号肽与目的基因拼接产物( α-ORF2128 - 660) ( 引物: α 上、HEV 下为引物) ，大小约为1 900 bp; 扩增结果与预期的一致 4 重组表达质粒α- ORF2128 - 660 /pAO8。