分析b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖分子量的方法的验证=“news_bd”> b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-核糖基核糖醇磷酸盐(polyribosyl ribitol phosphate，PRP)，其重复单位是由核糖醇、核糖、磷酸盐连接而成多糖重复单位中，核糖通过C1 位的羟基与核糖醇C1 位羟基位置相连，核糖醇C5 位的羟基则与磷酸形成酯键，而磷酸另一侧则与核糖C3 位羟基连接应用较多的测定PRP 分子量的方法为分子大小排阻层析法，是以一系列已知分子量的葡聚糖在该层析柱上对洗脱体积或时间作校正曲线，将待测样品的洗脱体积或时间代入曲线方程后，即可算得该样品的分子量近年来，高压液相分子排阻层析-十八角激光散射仪(high performance size exclusion chromatography-Multiangle laser-light scattering，HPSEC-MALLS)联用法以快速、高效、稳定等特点被WHO推荐纳入多糖质控体系默沙东公司、巴斯德公司研究人员使用高效液相排阻层析与多角度激光光散射仪、示差检测器联用技术(high performance size exclusion chromatography-Multiangle laser light scattering-Refractive index，HPSEC-MALLS-RI)分别对b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖、上市的23价肺炎球菌多糖疫苗PNEUMOVAX誖23(纽莫法)中包括的各血清型荚膜多糖分子量进行了测定。
本研究参照美国FDA生物分析方法验证指南，对HPSEC-MALLS 方法的准确性和精密度进行验证，再用该方法对15 批兰州生物制品研究所有限责任公司生产并检定合格的b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖的分子量及其分布进行检测，并初步分析其与传统的分子大小指标分配系数(KD)的相关性，以期为多糖及结合疫苗质量控制方法的优化提供参考 1 材料与方法 1. 1 多糖、类毒素及蛋白 15 批b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素[tetanus toxoid，TT，重均分子量(weight-average molecular weight，Mw)为157 799 g /mol]均由兰州生物制品研究所有限责任公司生产并检定合格;牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)购自美国Sigma-Aldrich 公司，Mw 为66 352 g /molTT 与BSA 的Mw 均经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱测得 1. 2 主要试剂及仪器 普鲁兰多糖分子量标准品盒Shodex STANDARD P-82[内含标准品P-20(Mw：2. 28 ×104 g /mol)、P-200(Mw：21. 2 ×104 g /mol)、P-400(Mw：40. 4 ×104 g /mol)、P-800(Mw：78. 8 ×104 g /mol)]购自日本Shodex 公司;氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司;高压液相色谱仪购自美国Waters 公司;DAWNHELEOS-域十八角激光散射仪、Optilab T-rEX 示差检测器均购自美国Wyatt 公司;TSK 层析柱及其保护柱均购自日本TOSOH公司。
1. 3 方法的验证 1. 3. 1 准确性验证分别称取普鲁兰多糖标准品P-20、P-200、P-400、P-800各5. 0 mg，用流动相(pH 7. 0的0. 01 mol /L磷酸盐缓冲液)溶解至2. 0 mg /ml待溶解完全后，经0. 22 μm 滤膜过滤至样品瓶中TSK 层析柱用0. 01 mol /L 磷酸盐缓冲液平衡后，依次上样100 μl，流速0. 5 ml /min，每个样品运行时间40 min，使用ASTRA5. 3. 4 软件进行记录，分析处理，计算Mw、分布情况[多聚分散度= Mw /数均分子量(number average molecular weight，Mn)]及相对偏差，每个样品平行测定3次将TT和BSA分别用流动相(pH7.0的0.01mol/L磷酸盐缓冲液)稀释至1. 0 mg /ml，经0. 22 μm滤膜过滤至样品瓶中检测Mw及其分布情况，方法同上 1. 3. 2 精密度验证分别称取普鲁兰多糖分子量标准品P-20、P-200、P-400、P-800 各5. 0 mg，用流动相(pH 7. 0的0. 01 mol /L 磷酸盐缓冲液)溶解至2. 0 mg /ml。
溶解完全后，0. 22 μm滤膜过滤至样品瓶中按照1. 3. 1项进样条件重复进样5 次，计算样品的Mw 及相对标准偏差(relative standard clevia-tion，RSD)1. 4 15批b型流感嗜血杆菌荚膜多糖Mw 的测定将15批b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶解至2. 0mg/ml，按1. 3. 1项进样条件检测Mw 及其分布情况，每个样品重复检测3次1. 5 b型流感嗜血杆菌荚膜多糖KD 值与Mw 相关性的检测15 批b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖的KD值已通过Sepharose CL-4B层析柱测得，将KD值与本实验测得的Mw进行比较，观察二者间的相关性 2 结果 2. 1 方法的验证结果 2. 1. 1 准确性不同分子量普鲁兰多糖标准品Mw的检测值与标示值比较，除P-20 3次测量结果相对偏差大于5%外，其余标准品均小于5%TT、BSA单体含量均大于95%，该方法测定其单体分子量分别为1. 593 ×105和6. 721 ×104 g /mol，测定值与标示值的相对偏差均小于5%表明该方法具有良好的准确性 2. 1. 2 精密度不同分子量的普鲁兰多糖标准品分别连续进样5 次，Mw 的RSD均小于0. 5%;且5 次平行测定的色谱峰及分子量分布趋势线完全重叠。
表明该方法重复性良好 2. 2 15 批b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖的Mw 15批b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖Mw(3 次检测的平均值)为2. 681 ×105 ~ 6. 488 ×105 g /mol，各批次多糖Mw 的RSD除PRP-7(6. 87%)和PRP-8(7. 41%)，其他均小于5%15 批b型流感嗜血杆菌荚膜多糖分子量分布均随洗脱时间的延长呈现逐渐降低的趋势，符合多聚物的分子量分布特征，且3 次上样的分布曲线均完全重叠PRP-1 多糖连续3 次上样的分子量分布趋势图(激光信号. 2. 3 b型流感嗜血杆菌荚膜多糖KD 值与Mw 的相关性 15 批b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖KD值大部分位于Sepharose CL-4B 外水体积附近，表明其在该层析柱上并未完全分离，在外水体积处呈堆积状态而测定Mw时，样品在分离范围适宜的层析柱上是有效分离的因此，在此比较KD与Mw，二者无明显相关性 3 讨论 目前，国内仍然主要采用传统的Sepharose CL-4B 或CL-2B 层析柱对多糖的分子量大小及其分布进行分析，其结果仅表征了多糖分子在该层析柱内的分配系数，无法直观地了解分子量大小，尤其较难表征超出该层析介质分离范围的多糖分子量大小。
本研究所采用HPSEC-MALLS 分析法为近年来国际通用的多糖分子量分析方法，已被《欧洲药典》及WHO 结合疫苗的相关规程列为分子量检定的标准方法该方法更精确、高效、直观，得到越来越广泛地应用本研究建立了HPSEC-MALLS测定b型流感嗜血杆菌荚膜多糖分子量方法，并验证了方法的准确性和精密度验证结果表明，该方法具有较高的准确性，与标准品的标示分子量偏差极小，且重复性良好用该方法初步对兰州生物制品研究所有限责任公司生产的15 批b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖进行分子量测定，测得Mw(3次检测的平均值)为2. 681 ×105 ~ 6. 488 ×105 g /mol，表明纯化工艺较为稳定，今后将进一步进行分子量数据的积累为明确传统的KD 值与本法测得的Mw 的相关性，本实验将15 批多糖的KD值与其Mw进行比较，由于Sepharose CL-4B 层析柱和本研究采用层析柱的排阻上限差别较大，本研究采用层析柱上可分离开的大分子多糖，在Sepharose CL-4B 层析柱上不能有效分离，出峰全部在外水体积附近，导致KD 值和Mw 相比无明显相关性因此，探寻二者相关性的前提是样品在层析柱上可充分分离。
本实验为多糖及结合疫苗质量控制方法的优化提供了参考。