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1、15-脱氧-前列腺素J2对巨噬细胞移动抑制因子表达的影响=“news_bd” 巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)是一种具有多种生物学功能的细胞因子，位于炎症瀑布的上游，可以调节炎性因子的产生和释放，通过自分泌或旁分泌方式发挥作用，促使巨噬细胞聚集在损伤区域。研究发现，15-脱氧-前列腺素J2(15-Deoxy-Δ12，14-prostaglandinJ2，15d-PGJ2)能够在慢性肝损伤时抑制小鼠体内骨髓来源的单核巨噬细胞(bonemarrowderivedmonocyte/macrophage，BMM)向损伤区
2、域募集，并能够抑制体外培养小鼠单核巨噬细胞的生物学功能，但其作用靶点尚未明确。本研究以小鼠单核巨噬细胞系J774A.1为研究对象，以MIF为靶分子，在体外脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症模型中探讨15d-PGJ2对MIF表达的影响及其机制。材料和方法材料小鼠单核巨噬细胞系J774A.1(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心细胞库);DMEM培养基(美国Invitrogen公司)，胎牛血清(德国Biochromag公司)，胰蛋白酶、β-巯基乙醇、青霉素/链霉素(美国GIBICO/BRL公司)，15d-PGJ2(美国AnnArbor公司)，LPS(美国
3、Sigma公司);RNeasyMimiKit(德国Quagen公司)，M-MLV逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)，SYBRGreenPCRMasterMix，TaqmanUniversalPCRMasterMix(美国ABI公司);抗GAPDH单克隆抗体(美国CellSignalingTechnology公司)，抗MIF多克隆抗体、抗F4/80多克隆抗体、抗PPAR-γ多克隆抗体(美国SantaCruzBiotechenology公司)。细胞培养 J774A.1接种于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液中，置于37、5%CO2细胞培养箱中培养，接种密度1
4、×106/r=10cm细胞培养皿或3×105/r=6cm细胞培养皿，细胞汇合到90%时进行传代，取对数生长期细胞进行实验。细胞的药物处理 细胞汇合到80%时给予药物处理。细胞饥饿12h，分别给予以下处理:(1)LPS组:1μg/mlLPS孵育1h;(2)正常对照组:LPS的溶剂PBS孵育1h;(3)阴性对照组:5μmol/L15d-PGJ2孵育1h;(4)15d-PGJ2组:5μmol/L15d-PGJ2预孵育1h，1μg/mlLPS孵育1h;(5)GW9662组:10μmol/LGW9662预孵育1h，5μmol/L15d-PGJ2
5、孵育1h，1μg/mlLPS孵育1h;(6)Vehicle组:即GW9662对照组，使用GW9662的溶剂DMSO替代GW9662。细胞免疫荧光 细胞接种于96孔板中，1×104/孔，贴壁后用预冷的PBS清洗，4%多聚甲醛室温避光固定15min;用0.5%TritonX-100进行膜通透处理，2%BSA封闭;MIF(150)抗体孵育，4过夜;F4/80(1200)抗体孵育，371h;加入相应荧光标记二抗，371h，避光;DAPI染细胞核后高内涵自动成像系统进行扫描。阴性对照组不加一抗，其余处理与实验组相同。RT-qPCR 处理后的细胞用预冷PBS清洗，加入350μl裂解
6、液，收集裂解底物提取全细胞RNA(QIAGENRNeasyMiniKit)，定量(NanoVue)后取0.5μg逆转录(不加逆转录酶作为阴性对照，即NO-RT)，cDNA稀释后进行PCR反应，引物序列。检测的临界点设定在PCR扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(Ct)作为模板初始浓度的间接指标，溶解曲线分析采用默认条件。结果以18SrRNA进行校正，用ΔΔCt法计算相对基因表达量。取PCR产物DNA进行琼脂糖凝胶电泳。胶浓度为2%，电压为100V，电泳时间45min，紫外灯下观察并打印胶片。Westernblot检测 处理后的细胞用预冷
7、的PBS清洗，0.125%胰酶消化后加入蛋白裂解液，提取全细胞蛋白，BCA法蛋白定量(BCATMproteinassaykit)。取50μg总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(胶浓度15%)，转膜至0.2μm的PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1h，孵育MIF抗体(1200稀释)，4过夜。PBST洗膜5min，3次，孵育相应二抗，室温避光1h。PBST洗膜后Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描成像并进行定量分析。内参GAPDH测定步骤相同。免疫荧光法测定 细胞内过氧化物酶体增殖物激活受体γ的含量及高内涵分析细胞接种于96孔培养板中，每孔1×104个细胞，
8、过夜贴壁。给予药物处理后，进行免疫荧光染色，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-γ，PPAR-γ)抗体(150稀释)孵育，DAPI染细胞核后使用高内涵仪器配备的ThermoScientificCellInsightpersonalcellimaging(PCI)平台及ThermoScientificCellomicsiDEV软件对96孔板进行扫描成像。机器扫描时，每孔随机选取49个视野，且细胞数目不小于4000个。采用CellomicsCellHealthProfilingBioAp
9、plication软件对荧光强度信息进行分析，定量测定各处理条件下J774A.1中PPAR-γ的含量。分析结束后，根据需要选择输出图像和数据统计结果。结果以细胞核内荧光强度/细胞质内荧光强度±标准误形式给出。统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，数据以均数±标准误表示，组间比较采用student’st检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果J774A.1在基因和蛋白水平均表达MIF细胞免疫荧光检测结果显示，MIF蛋白(红色荧光)在J774A.1中有表达，且与小鼠单核/巨噬细胞的表面标志物F4/80(绿色荧光)有共定位。引物设计PC
10、R产物MIF片段的分子量为118bp，用琼脂糖凝胶电泳技术在相应位置检测到MIF的存在。15d-PGJ2下调J774A.1细胞炎症模型中MIFmRNA和蛋白表达水平用1μg/mlLPS诱导J774A.1炎症反应，RT-qPCR方法检测到细胞中MIFmRNA表达上调到对照组的1.75倍(P=0.037)。给予细胞5μmol/L15d-PGJ2预孵育1h后再用LPS诱导炎症反应，细胞中MIFmRNA表达的上调被抑制，下调到LPS组的50%(P=0.026)。单独应用15d-PGJ2处理组细胞中MIFmRNA表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P=0.099)。MIF蛋白水平变化情况与
11、mRNA水平相一致。GW9662逆转15d-PGJ2对MIFmRNA和蛋白表达的抑制功能用PPAR-γ拮抗剂GW9662预处理细胞，再孵育5μmol/L15d-PGJ21h后，用1μg/mlLPS诱导细胞炎症反应，RT-qPCR检测结果显示，与Vehicle组相比，GW9662逆转了15d-PGJ2对MIFmRNA表达的下调(P=0.016)。单独给予GW9662处理对MIFmRNA表达无影响(P=0.26)。MIF蛋白水平变化情况与mRNA水平相一致。15d-PGJ2调节炎症反应时J774A.1中PPAR-γ的核转位细胞饥饿12h后，用1μg/mlL
12、PS诱导细胞炎症反应，给予或不给予5μmol/L15d-PGJ2处理，1h后终止。用免疫荧光技术特异性显示PPAR-γ后发现，与对照组相比，LPS组细胞内PPAR-γ的核质比没有明显变化(P=0.161)，15d-PGJ2处理组细胞的胞核中PPAR-γ含量明显上调。高内涵自动成像系统分析结果显示，15d-PGJ2处理组细胞中PPAR-γ的核质比上调至LPS组的1.39倍(P=0.003)。讨论炎症反应是组织器官受到损伤因素刺激后的一种免疫防御反应，是多种慢性疾病的主要诱发因素。作为免疫系统的第1道防线，单核巨噬细胞在接受LPS等刺激后可释放大量炎症介质和促炎因子，如MIF等，介导炎症反应的发生发展以及组织损伤。MIF是一种作用广泛的前炎症细胞因子，可通过自分泌和旁分泌的方式参与炎症反应，能够促进其他细胞因子(如肿瘤坏死因子α等)的产生、活化巨噬细胞、抑制其游走移动等。本研究明确了小鼠单核巨噬细胞系J774A.1表达MIF，且LPS诱导的J774A.1炎症反应模型中其表达上调，并发现该上调可被15d-PGJ2抑制，提示MIF可能是15d-PGJ2发挥抗炎功能的重要作用靶点。
