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1、黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化摘要柠檬酸2-羟基丙烷三羧酸，是重要的工业原料。可从植物原料中提取，也可由糖进展发酵制得。试验争辩了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。在菌浓度、发酵过程 PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进展了相关比较。结果说明：1摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为 0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度一样的状况下，随发酵进展，摇瓶发酵的温度更 稳定，两者的菌浓度、残糖、PH 值变化规律高度全都，酸度变化规律根本全都。另外试
2、验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进展了探讨，结果说明实罐发酵的最适温度约为 35，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶Abstractextracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we studied the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the diffe
3、rent concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PHduring the fermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during theCitric acid(2-hydroxytri
4、carboxylic acid), is an important industrial raw material. It can befermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfatefor the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfatefor the fermentation in fermenters is 0.5%.
5、when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugarcontent, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances,the fermentation in the erlenmeyer has more stable fermentat
6、ion temperature. Both the twomethods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residualsugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result showed that the produ
7、ction of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water.Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, ammoniumsulfate1. 课题背景1.1
8、柠檬酸简介1柠檬酸citric acid是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸2-hydroxytricarboxylic acid、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid。分子式：C6H8O7 相对分子质量：192.13物理性质：无色透亮或半透亮晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有猛烈酸味，但令人快活，稍有涩味。极易溶于水，溶解度随温度的上升而增大。化学性质：从构造上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物
9、，并因此而与其他羧酸有相像的物理和化学性质。加热至 175C 时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有 3 个 H+可以电离； 加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反响。1.2 柠檬酸用途2柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等， 用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外， 在药物、美容品、扮装品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等3。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极
10、为广泛而有良好的进展前景。1.3 柠檬酸循环citric acid cycle4又称三羧酸循环tricarboxylic acid cycle，克雷布斯循环(Krebs cycle)。体内物质糖、脂肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。通过生成的乙酰辅酶 A 与草酰乙酸缩合生成三羧酸柠檬酸开头，再通过一系列氧化步骤产生 CO 、NADH 及 FADH2，最终仍生成草酰乙酸，进2行再循环，从而为细胞供给了降解乙酰基而供给产生能量的根底。由克雷布斯 Krebs于20 世纪 30 年月最先提出。1.4 试验发酵机理1） 以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌我们承受黑曲霉M288糖化后产生高
11、浓度的葡萄糖。2） 、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP糖酵解途径或者、HMP磷 酸戊糖循环两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰 CoA，另一方面经CO2固定化反响后生成草酰乙酸，最终草酰乙酸和乙酰CoA 缩合产生柠檬酸。3） 生理调整：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积存是菌体代谢失调的结果。 1 Mn2+抑制蛋白质合成造成 NH4+的浓度增大，从而解除对 PFK 的抑制，使 EMP 通畅；2柠檬酸脱氢酶在柠檬酸浓度高的状况下活性降低，进一步促进柠檬酸的积存。1.5 发酵方法2发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵 3 种方法。固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的
12、农副产品为原料，配好培育基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲， 装入曲盘，在确定温度和湿度条件下发酵。承受固态发酵生产柠檬酸，设备简洁，操作简洁。 液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培育液通过管道转入一个个发酵盘 中，接入菌种，待菌体生殖形成菌膜后添加糖液发酵。发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。微生物在这个密闭容器内生殖与发酵。现多承受 通用发酵罐。它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受确定的压力,并有良好的密封性。除 通用式发酵罐外，还可承受带升式发
13、酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分别筛选，然后通过物理和化学方法进展菌种选育。例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过 柠檬酸不断变异和选育得到的。菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。1.6 黑曲霉菌柠檬酸发酵的影响因素2柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要把握确定的温度、通风 量及 pH 值等条件。一般认为，黑曲霉适合在 2830时产酸。温度过高会导致菌体大量生殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间 延长。微生物生成柠檬酸要求低 pH，最适 pH 为 24
14、，这不仅有利于生成柠檬酸，削减草酸等杂酸的形成，同时可避开杂菌的污染。柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵 液中维持确定的溶解氧量。通风和搅拌是增加培育基内溶解氧的主要方法。随着菌体生成， 发酵液中的溶解氧会渐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。承受增加空气流速及搅拌速度的 方法，使培育液中溶解氧到达60饱和度对产酸有利。柠檬酸生成和菌体形态有亲热关系， 假设发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；假设出 现异状菌丝体，而且菌体大量生殖，造成溶解氧降低，使产酸快速下降。尽管经过几十年的争辩5，关于柠檬酸发酵机制照旧有很多不够了解的地方，柠檬酸的合成积存涉及到
15、一系列的酶，它们是相互关联的，影响制约柠檬酸发酵的因子也是多种多样 的，发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有格外重要的作用，过量的金属离子引起产酸 率的降低，铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积存。柠檬酸发酵用的糖 蜜原料，因含有大量金属离子，必需应用离子交换法或添加亚铁氰化钾脱铁方能使用。然而 微量的锌、铜离子又可以促进产酸。相对来说，发酵培育基中的金属离子以及小分子量的有 机物是比较简洁把握的因子。但是每种因子的影响不是确定的，如金属离子 Fe2+ 、Mn2+ 等， 他们并不是可以无条件降低其浓度，同时它们也是微生物其它正常代谢途径中必需因子，我 们只能查找一个最适宜于柠檬酸发酵的浓度。资料说明6789：高浓度 Mn2+ 将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利于合成柠檬酸。铜离子能抑制柠檬酸裂解酶活力6，培育基中加 Cu2+ ，有利于到达最高柠檬酸产量。柠檬酸在顺乌头酸酶的催化下转化为顺乌头酸，进而转化为异柠檬酸，Fe2+是乌头酸水合酶专一激活剂，但柠檬酸发酵开头时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成作预备，随后要把握 Fe2+ 的存在才能开头并大量积存柠檬酸。Johnson 等在争辩黑曲霉的CO2固定作用时觉察有两个 CO固定系统，这两个系统需要 Mg2+、K +71112 。也有说几种2常见的金属离子对柠檬酸合成酶的抑制
