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1、酶联免疫吸附测定法 生物体系中的化学测量生物体系中的化学测量裴丹青裴丹青03081152 复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和预防的过程中也日益凸现其重要作用。预防的过程中也日益凸现其重要作用。 经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂且待测物浓度较低的测试条件则往往
2、无能为力。且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。 于是，一系列针对生物体系中化学成分的测于是，一系列针对生物体系中化学成分的测量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。 什么是什么是 酶联免疫分析技术酶联免疫分析技术 ELISAELISA的基本原理和方法的基本原理和方法 ELISAELISA的种类和变化的种类和变化 ELISAELISA的特点的特点 ELISAELISA的应用
3、实例的应用实例 19711971年瑞典学者年瑞典学者EngvailEngvail和和Perlmann,Perlmann,荷荷兰学者兰学者Van WeermanVan Weerman和和SchuursSchuurs分别报道将免分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) ELISA) 。ELISAELISA现在已成为目前分析化学领
4、现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic ( immunoenzymatic techniques ) techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术的免疫测定技术 。 一、基本原理一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。可
5、以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂） 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体
6、）反应结合后，上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶再加上酶的相应底的相应底物，即起物，即起催化水解催化水解或氧化还或氧化还原反应而原反应而呈颜色。呈颜色。 其所生成的颜色深浅与其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成欲测的抗原（抗体）含量成正比。正比。 这种有色产物可用肉眼、这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。（酶标仪）加以测定。 其方法简单，方便讯速，其方法简单，方便讯速，特异性强。特异性强。二、酶及其底物二、酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原, , 半抗原半抗原在
7、交联剂作用下联结的产物。是在交联剂作用下联结的产物。是ELISAELISA成败成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应将得到不同的颜色反应. .酶酶 底底 物物显色显色反应反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6
8、)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(
9、ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420420 ELISAELISA的种类和变化的种类和变化 （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法 （四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应用亲和素和生物素的ELISAELISA （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成
10、固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定
11、的定性或定量测定 间接法是检间接法是检测抗体最常用的方测抗体最常用的方法，其原理为利用法，其原理为利用酶标记的抗抗体以酶标记的抗抗体以检测已与固相结合检测已与固相结合的受检抗体，故称的受检抗体，故称为间接法。为间接法。（二）间接法（二）间接法包被固相载体包被固相载体: : 用已知抗原包被用已知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本: : 使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体: :与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底
12、物显色显色 根据颜色反应的程度进行根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定（三）竞争法（三）竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体量测定，也可用于测定抗体 。用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定管加待测抗原和测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的
13、吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量 对照管由于只加酶标抗原，与固对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。底物后显色反应
14、较弱。 特点一：灵敏性特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告集团的该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众所周知酶。众所周知, , 酶是一种有机催化剂，很少酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。酶放大体系。ELISAELISA实现了在细胞或亚细胞水实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。甚至纳克水平上对其进行定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时
15、，例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平，酶反应测水平，酶反应测定法的敏感度约为定法的敏感度约为510g/ml 510g/ml 。 特点二：特异性特点二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。特异性。 例如乙肝病毒中的例
16、如乙肝病毒中的表面抗原（表面抗原（HBsAgHBsAg）、）、e e抗原（抗原（HBeAgHBeAg）和核心抗）和核心抗体（体（HBcAgHBcAg），虽来源于），虽来源于同一病毒，但仅与其相同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需一特定的物质，而不需先分离待检物。先分离待检物。ELISAELISA应用实例应用实例 饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏（如沙门氏菌菌 ） 甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测河豚毒
