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1、抗酸染色抗酸染色Acid-FastStain原理：原理：由于分歧杆菌的胞壁含大量由于分歧杆菌的胞壁含大量脂质，主要是分枝菌酸脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，可采用可采用加温、延长着色时间加温、延长着色时间或或提高染料浓度提高染料浓度等手段使其等手段使其着色。但分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂着色。但分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。故分歧杆菌又称为抗酸杆菌，这种染色方法又成脱色。故分歧杆菌又称为抗酸杆菌，这种染色方法又成为抗酸染色。为抗酸染色。延长时间：延长时间：5min提高染料浓度：初染
2、用的酸复红浓度是革兰染色酸复红浓度提高染料浓度：初染用的酸复红浓度是革兰染色酸复红浓度的的10倍倍盐酸酒精：脱色能力远远强于盐酸酒精：脱色能力远远强于95%酒精酒精原理：原理：齐齐-尼氏抗酸染色法是在尼氏抗酸染色法是在加热条件下加热条件下使分枝菌使分枝菌酸与酸与石炭酸复红石炭酸复红牢固结合成复合物，用牢固结合成复合物，用盐酸酒精盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。色。目的要求：目的要求：初步掌握抗酸染色的操作、结果判断。初步掌握抗酸染色的操作、结果判断
3、。材料：材料：结核病人痰液、载玻片、酒精灯、接种环结核病人痰液、载玻片、酒精灯、接种环抗酸染色液：抗酸染色液：石炭酸复红液、石炭酸复红液、3%盐酸酒精溶液、吕氏美蓝盐酸酒精溶液、吕氏美蓝溶液。溶液。方法：方法：1、涂片：、涂片：（1）取病患清晨痰液）取病患清晨痰液（2）取干酪样坏死或带血小块，涂成薄膜状）取干酪样坏死或带血小块，涂成薄膜状（3）自然干燥，外焰固定，染色）自然干燥，外焰固定，染色2、抗酸染色、抗酸染色（1）初染：）初染：夹住涂片一端，持平，滴加夹住涂片一端，持平，滴加石碳酸复红石碳酸复红染液，染液，使之完全覆盖标本，（或在已固定的结核分枝使之完全覆盖标本，（或在已固定的结核分枝杆
4、菌痰标本涂片上放一小块滤纸片，之后滴加杆菌痰标本涂片上放一小块滤纸片，之后滴加数滴石炭酸复红液后，）置数滴石炭酸复红液后，）置酒精灯高处徐徐加酒精灯高处徐徐加热热，待染液，待染液出现蒸汽出现蒸汽时移开，蒸汽减少时再加时移开，蒸汽减少时再加热，热，反复操作反复操作3-5分钟分钟。注意：注意：不要使染液沸腾不要使染液沸腾，若蒸发减少，可待玻片，若蒸发减少，可待玻片稍冷却后适当补充。稍冷却后适当补充。（2）待玻片冷却后，用水缓慢冲洗，用吸水纸吸）待玻片冷却后，用水缓慢冲洗，用吸水纸吸干。干。（3）脱色：滴加）脱色：滴加3%盐酸酒精盐酸酒精，轻晃玻片，直至，轻晃玻片，直至无红色液体流下无红色液体流下为
5、止，一般作用为止，一般作用13min*，水，水洗，吸干。洗，吸干。（4）复染：用）复染：用碱性美兰溶液碱性美兰溶液复染复染1min，用水冲，用水冲洗后吸干。洗后吸干。（5）*：不同文献报道不同，范围在：不同文献报道不同，范围在30s至至3min3、油镜观察、油镜观察结果：结果：结核分枝杆菌结核分枝杆菌染成红色染成红色，菌体，菌体细长细长，有时微弯，呈分，有时微弯，呈分枝状排列，有时着色不均匀，呈颗粒状。非抗酸菌及枝状排列，有时着色不均匀，呈颗粒状。非抗酸菌及标本中其他细胞均染成蓝色。标本中其他细胞均染成蓝色。直接涂片直接涂片：仔细观察至少：仔细观察至少300视野未发现抗酸菌；视野未发现抗酸菌；
6、士：士：300个视野内发现个视野内发现12个抗酸菌（全部涂膜镜检个抗酸菌（全部涂膜镜检3遍）；遍）；+：100个视野内发现个视野内发现19个抗酸菌（全部涂膜镜检个抗酸菌（全部涂膜镜检1遍）；遍）；2+：10个视野内发现个视野内发现19个抗酸菌；个抗酸菌；3+：每个视野内发现：每个视野内发现19个抗酸菌；个抗酸菌；4+：每个视野内发现：每个视野内发现9个以上的抗酸菌。个以上的抗酸菌。集菌涂片结果集菌涂片结果*：按按“发现抗酸染色发现抗酸染色阳性细菌阳性细菌”或或“未发现抗酸染色阳性细菌未发现抗酸染色阳性细菌”报告。报告。集菌涂片：、沉淀集菌法。取痰液23ml，40g/lNaOH12倍量混匀。经1
7、03.43Pa高压灭菌2025min（或煮30min），3000r/min离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片做抗酸染色或金胺“0”荧光染色镜检；、漂浮集菌法。取晨痰23ml放入100ml三角瓶内，加12倍量40g/lNaOH溶液，经103.43Pa高压灭菌2025min（或煮30min）。冷却后滴加汽油0.3ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶口，置振荡器或手摇振荡10min，再加蒸馏水至满瓶口而又不外溢，静置1015min，将已编号的洁净载玻片盖在瓶口上，静置1520min，取下载玻片并迅速将载玻片翻转至浸膜向上，或用接种环取瓶口液面物涂于载玻片上，自然干燥，火焰固定后做抗酸染色或金胺“0”荧
8、光染色，镜检。注意事项每张载玻片只允许涂1份标本，不得涂2份或2份以上标本，以免染色过程中菌体脱落而导致阴阳结果混淆。使用过的玻片要彻底清洗干净后才能再次使用，以防抗酸菌遗留在玻片上。抗酸染色时切勿使用染色缸。用于吸水的滤纸只能1片1张，不可重复使用。镜检时每检查1份标本后，均需揩拭油镜头。滴加香柏油的玻璃棒或竹签不得触及玻片。抗酸染色时，脱色剂脱色时间宁长勿短，结核分枝杆菌脱色时间长至1020min而不被脱色；而非抗酸菌则易脱色，故延长脱色时间有一定的鉴别作用。为了防止实验室感染，可先将待检的结核分枝杆菌标本高压灭菌后，涂片染色。这样既安全又不影响实验结果（此法仅用于大规模实验）。恙虫病立克
9、次体（恙虫病立克次体（R.tsutsugamushi）是恙虫）是恙虫病的病原体病的病原体 ，短杆状，平均长度短杆状，平均长度1.2um，常，常见成双排列，在细胞质近核处聚集生长。见成双排列，在细胞质近核处聚集生长。 标本来源：腹水涂片标本来源：腹水涂片 染色：染色：Giemsa镜下描述：细胞核边镜下描述：细胞核边 大量大量 紫红色球杆状菌体紫红色球杆状菌体 名称：恙虫病立克次体名称：恙虫病立克次体意义：恙虫病意义：恙虫病二二 立克次体立克次体立克次体呈多形态性，球杆状或杆状，立克次体呈多形态性，球杆状或杆状，大小为大小为0.30.6mX0.82.0m。革。革兰染色阴性，但着色不明显，常用马基兰
10、染色阴性，但着色不明显，常用马基维罗或维罗或Giemsa法染色，前者立克次体法染色，前者立克次体被染成红色，染色效果好，后者染成紫被染成红色，染色效果好，后者染成紫色或蓝色。色或蓝色。Giemsa染色，染色，X1000恙虫热立克次体，恙虫热立克次体，X1000没有细胞壁的原核生物。基因是环状双链没有细胞壁的原核生物。基因是环状双链DNA，目前已知，目前已知80多种支原体，能在无生命多种支原体，能在无生命培养基中生长繁殖的最小微生物。培养基中生长繁殖的最小微生物。 由于支原体无细胞壁，故呈多形态性，常见由于支原体无细胞壁，故呈多形态性，常见的为球状、杆状、丝状及环状。本病原的染的为球状、杆状、丝
11、状及环状。本病原的染色性较差，革兰氏染色呈阳性，可用姬姆萨色性较差，革兰氏染色呈阳性，可用姬姆萨或瑞特氏染色。或瑞特氏染色。 三三 支原体支原体电镜下，电镜下，肺炎支原体电镜下，肺炎支原体(球形球形)电镜下，肺炎支原体电镜下，肺炎支原体 1、钩端螺旋体、钩端螺旋体 体呈圆柱形但纤细，大小约体呈圆柱形但纤细，大小约0.10.2m612m。螺旋细密而规则，菌体一端或两端弯。螺旋细密而规则，菌体一端或两端弯曲呈钩状，整个菌体呈曲呈钩状，整个菌体呈C、S形状。形状。钩体的最外层钩体的最外层为外膜，其内为螺旋状的肽聚糖层和胞膜包绕的细胞质，在外膜与为外膜，其内为螺旋状的肽聚糖层和胞膜包绕的细胞质，在外膜
12、与肽聚糖层之间有两根轴丝（内浆鞭毛），各由一端伸至菌体的中央。肽聚糖层之间有两根轴丝（内浆鞭毛），各由一端伸至菌体的中央。常用常用Fontana银染色法，将其染成棕褐色。银染色法，将其染成棕褐色。 四四 病原性螺旋体病原性螺旋体Fontana银染色法，将其染成棕褐色。银染色法，将其染成棕褐色。X10002、梅毒螺旋体、梅毒螺旋体 形体细长且两端尖直，螺旋致密而规则，运动形体细长且两端尖直，螺旋致密而规则，运动活泼。大小约活泼。大小约615m0.10.2m。菌体表。菌体表面有荚膜样物质，其化学组成为脂多糖。面有荚膜样物质，其化学组成为脂多糖。 圆柱体表面绕有圆柱体表面绕有34根轴丝，也称内鞭毛（
13、根轴丝，也称内鞭毛（endoflagella），与运动），与运动有关有关.外膜蛋白具有高度免疫原性，在免疫学诊断及预防中可能起到外膜蛋白具有高度免疫原性，在免疫学诊断及预防中可能起到重要作用。梅毒螺旋体基因为环状重要作用。梅毒螺旋体基因为环状DNA，长约，长约1000kb，有，有1041个个ORF，半数以上，半数以上ORF具有生物学功能。具有生物学功能。 普通染色不易着色，常采用普通染色不易着色，常采用Fontana镀银染色镀银染色法将其染成棕褐色，菌体变粗在光镜下易于查法将其染成棕褐色，菌体变粗在光镜下易于查见。见。新鲜病变标本可直接在暗视野显微镜下，新鲜病变标本可直接在暗视野显微镜下，观察
14、其形态与运动方式。观察其形态与运动方式。 电镜观察其结构有细胞壁和细胞膜，电镜观察其结构有细胞壁和细胞膜，细胞膜内为含有细胞质和核质的原生质圆柱体细胞膜内为含有细胞质和核质的原生质圆柱体。Fontana镀镀银染色银染色X1000暗视野梅毒螺旋体暗视野梅毒螺旋体真菌大分生孢子真菌大分生孢子分生孢子（分生孢子（conidium）由菌丝末端细胞分裂形成，也由菌丝末端细胞分裂形成，也可在菌丝侧面出芽形成，它又可分为体积较大，由多个可在菌丝侧面出芽形成，它又可分为体积较大，由多个细胞组成的大分生孢子和体积较小，只含一个细胞的小细胞组成的大分生孢子和体积较小，只含一个细胞的小分生孢子。分生孢子。真菌小分生孢子真菌小分生孢子
