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饲料中精氨酸水平对大菱鲆幼鱼生长、血浆游离氨基酸和肠道形态的影响

杨***
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饲料中精氨酸水平对大菱鲆幼鱼生长、血浆游离氨基酸和肠道形态的影响_第1页
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    饲料中精氨酸水平对大菱鲆幼鱼生长、血浆游离氨基酸和肠道形态的影响    高中月 王旋 何艮摘要:为研究在饲料中添加不同水平的精氨酸对大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)幼鱼生长、血浆游离氨基酸和肠道组织结构的影响,以酪蛋白和明胶为蛋白源设计三组等氮等脂的纯化饲料,在基础配方中分别添加0%、2%、4%的晶体L-精氨酸,分别命名为LA、MA和HA处理组,用上述 3种试验饲料分别饲喂初始体重为(13.30±0.01)g的大菱鲆幼鱼8周结果显示,精氨酸不足(LA)和精氨酸过量(MA)都显著降低了鱼体的生长性能 (P<0.05)这些结果表明精氨酸在大菱鲆的生长、氨基酸代谢和肠道健康上发挥着重要的作用关键词:精氨酸;生长;血浆游离氨基酸;肠道形态;大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)精氨酸是鱼类的必需氨基酸之一,在蛋白质的合成和代谢方面都发挥着重要的作用精氨酸也是肌酸、多胺、一氧化氮(NO)等多种生物活性物质的前体,具有调节鱼体的能量代谢、免疫反应和内分泌等多种生理功能[1-2]大量的研究表明精氨酸缺乏会造成哺乳动物、家禽、鱼类的生长缓慢、饲料利用下降、肠道损伤、氧化损伤等问题[3-5]。

肠道是水产动物重要的营养和免疫器官,是氨基酸末端消化吸收和代谢的主要场所[6]在哺乳动物和细胞水平上的研究表明精氨酸在维持肠道健康、预防肠道疾病和修复肠道损伤方面发挥着重要的作用[7-9]然而,对于自身不能合成精氨酸或合成精氨酸能力很弱的鱼类,精氨酸对鱼类肠道影响的研究却非常有限大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)在我国俗称“多宝鱼”,是一种我国北方广泛养殖的海水底栖肉食性鱼类大菱鲆的人工养殖高度依赖于人工配合饲料的质量,营养物质的缺乏或不平衡容易造成大菱鲆的肠道损伤,从而影响鱼体的生长和品质因此,本实验通过设计不同精氨酸水平的饲料,研究其对大菱鲆幼鱼的生长性能、血浆游离氨基酸和肠道组织结构的影响为保证研究目的,实验饲料以纯化饲料为基础以避免其他因子可能造成的影响1材料和方法1.1饲料配方和饲料制作以Wang[10]的实验饲料配方为参考,设计三组等氮(52%粗蛋白)等脂(12.5%粗脂肪)的纯化饲料按照大菱鲆幼鱼鱼体氨基酸组成添加除精氨酸以外的其他晶体氨基酸,设计出精氨酸缺乏的基础配方[11]然后在基础配方中分别添加0%、2%、4%的晶体L-精氨酸(纯度>99%,青岛福林生物科技有限公司),分别命名为LA、MA和HA处理组,具体实验配方见表1。

饲料精氨酸的实测值为LA(1.50%)、MA(3.46%)、HA(5.45%),实验饲料氨基酸组成见表2酸0.13,丙氨酸132,天门冬氨酸1.63,甘氨酸1.62,丝氨酸0.42,半胱氨酸040,酪氨酸0.104维生素预混料(mg/kg饲料):维生素A,32;维生素D,5;维生素E,240;维生素K,10;维生素B1,25;维生素B2,45;维生素B6,20;维生素B12,10;泛酸钙,60;烟酸,200;叶酸,20;生物素,60;肌醇,800;维生素磷酸酯,2 000;微晶纤维素,16 4735矿物质预混料(mg/kg饲料):MgSO4·7H2O, 1 200; CuSO4·5H2O, 10; FeSO4·7H2O, 80; ZnSO4·H2O, 50; MnSO4 ·H2O, 45; CoCl2, 5; Na2SeO3,20; 碘酸钙, 60; 沸石粉, 8 4856复合诱食剂:甜菜碱∶二甲基-丙酸噻亭∶甘氨酸∶丙氨酸∶5-磷酸肌苷=4∶2∶2∶17精氨酸:(福林生物科技有限公司,山东,中国)L-精氨酸,纯度99.8%饲料制作前,饲料原料经超微粉碎机粉碎并过320 μm筛然后按照饲料配方将各种饲料原料准确称量并充分混合。

然后再加入适量的蒸馏水并用手充分揉匀最后将混合好的饲料原料放入自动制粒机中制成大小均匀的饲料颗粒,将饲料颗粒在50 ℃恒温下热风干燥8 h,将风干后的饲料置于双层塑料袋中,并保存在-20 ℃冰箱中1.2实验过程和饲养管理实验用大菱鲆幼鱼是从山东省莱州市大菱鲆种苗场购买的当年人工培育的同一批苗种养殖实验在青岛亿海丰水产有限公司养殖系统中进行实验开始之前,用MA处理组饲料暂养大菱鲆幼鱼2周,以使大菱鲆幼鱼适应养殖系统环境和纯化饲料暂养结束后将实验鱼禁食24 h,挑选规格均一、体格健壮的大菱鲆幼鱼(初始平均体重:13.30± 0.01 g),并随机分配于9个养殖桶(300 L),每桶30尾养殖实验周期为8周,每天按照大菱鲆体重的1.5%定量投喂两次(8:00和18:00),饲喂量每两周根据每桶的鱼体总重调整一次摄食结束后进行换水以保证水质养殖试验期间,水温保持在18~22 ℃,盐度29‰~32‰,氨氮小于0.1 mg/L,亚硝酸盐小于0.1 mg/L,溶解氧含量大于7 mg/L1.3样品采集养殖实验结束后,实验鱼被禁食24 h以达到基础的新陈代谢水平取样前将试验鱼用丁香酚(纯度99%,1∶10 000)麻醉,然后分别统计每桶鱼的重量和数量并随机选取5尾鱼用于鱼体常规成分分析。

每桶随机选取2尾鱼,分别测量其鱼体重量、鱼体长度、内脏团重量、肝脏重量并记录数据每桶随机选择3尾鱼,用注射器从鱼的尾静脉取出血液并将其放入抗凝管中,然后将血液在4 ℃ 3 000 g下离心5 min,将离出的上清液收集在离心管中并储存在-80 ℃冰箱备用每桶再随机选择2尾鱼用于肠道组织学分析取样,选取后肠中间部分(约0.5 cm长)放入事先配好的波恩氏液中,24 h后转入70%酒精中直到进行肠道组织分析1.4鱼体和饲料常规组成分析鱼体和饲料常规成分分析均采用 AOAC制定的方法其中水分的测定采用105 ℃ 烘箱烘干至恒重的方法求得;粗蛋白质含量采用全自动凯氏定氮仪(Kjeltec 8400,瑞典FOSS)测定;粗脂肪含量采用索氏抽提仪(Soxtec 8000,瑞典 FOSS)测定1.5原料和饲料氨基酸组成分析将饲料原料和饲料用冷冻干燥机冻干(ALPHA1-2 LD plus,德国Christ),随后在水解管中加入20~40 mg样品(准确称量),然后加入10 mL 6 M HCl,用氮吹仪排出水解管中的空气后将其密封,在110 ℃条件下水解22 h将水解好的样品用50 mL的容量瓶定容并充分混合,然后准确吸出1 mL转入到离心管里,用氮吹仪将离心管里的液体吹干后加入1 mL 0.02 M HCl并充分溶解。

最后,溶液用0.2 μm滤膜过滤并导入到进样瓶里,使用配备钠离子交换柱的全自动氨基酸检测仪(L-8900,日本HITACHI)检测氨基酸含量1.6血浆游离氨基酸分析将冷冻的血浆样品在4 ℃下解冻,解冻后将每个样品准确吸取400 μL加入1.2 mL 10%磺基水杨酸并充分混合,静止5 min后,13 000 r/min 4 ℃离心15 min,然后吸取上清液1 mL左右并用0.2 μm滤膜过滤到进样瓶中,使用配备锂离子交换柱的全自动氨基酸检测仪(L-8900,日本HITACHI)检测游离氨基酸含量1.7肠道组织学分析后肠组织样品经过波恩氏液固定、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片机切片(5 μm)、苏木精-伊红染色制成肠道组织切片在带有拍照系统的光学显微镜下(Olympus, CX31)用AJ-VERT软件统计后肠褶皱高度(HF)、肠上皮细胞高度(HE)和微绒毛长(HMV)1.8计算公式和统计方法存活率(SR,%)=100×鱼终末数量/鱼初始数量增重率(WGR,%)=100×(鱼终末体重-鱼初始体重)/鱼初始体重特定生长率(SGR,%/d)=100×(ln鱼终末体重-ln鱼初始体重)/养殖天数饲料效率(FE)= 鱼体湿增重/摄食饲料量蛋白质效率(PER)= 鱼体湿增重/摄食蛋白量肥满度(%)= 100×鱼体重/鱼体长3肝体比(HSI,%)= 100×肝脏重/鱼体重脏体比(VSI,%)= 100×内脏团重/鱼体重试验数据用平均值±标准误(M±SE)表示,采用 SPSS 17.0 版软件对所得数据进行数据分析和统计,先对数据作单因子方差分析(ANOVA),若处理间有显著差異,再作 Tukeys多重比较,P<0.05 表示差异性显著。

2结果2.1生长性能和饲料利用饲料中精氨酸水平对大菱鲆幼鱼生长性能和饲料利用的影响如表3所示所有大菱鲆幼鱼在养殖期间均未出现死亡然而,与MA组相比,精氨酸缺乏(LA组)显著降低了鱼体的终末体重(FBW)、增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料效率(FER)和蛋白质效率(PER)(P<0.05)另外,与MA组相比,饲料中过量的精氨酸水平(HM组)也造成了鱼体的终末体重(FBW)、增重率(WGR)和特定生长率(SGR)的降低(P<005)2.2形态指标和鱼体组成饲料中精氨酸水平对大菱鲆幼鱼形态指标和鱼体组成的影响如表4所示饲料中精氨酸水平的改变并没有引起大菱鲆肥满度(CF)、肝体比(HSI)、脏体比(VSI)的显著性变化(P>0.05)然而,与LA组和MA组相比,HA组的鱼体水分显著提高,粗脂肪显著降低(P<0.05)2.3血浆游离氨基酸饲料中精氨酸水平对大菱鲆幼鱼血浆游离氨基酸的影响如表5所示在必需氨基酸方面,LA组的血浆游离精氨酸显著低于MA组(P<005),HA组的血浆游离精氨酸显著高于MA组(P<0.05)另外,LA组的血浆游离蛋氨酸和苏氨酸显著低于MA组(P<0.05)在非必需氨基酸方面,与MA组相比,HA组的血浆游离天门冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸显著降低,LA组的血浆游离丝氨酸显著升高(P<0.05)。

2.4肠道组织形态饲料中精氨酸水平对大菱鲆幼鱼肠道组织形态的影响如图1所示,组织学参数如表6所示LA组的肠道褶皱高度(HF)和肠道微绒毛高度(HMV)显著低于MA组(P<0.05)MA组的肠上皮细胞高度(HE)显著低于MA组和HA组(P<0.05)HA组与MA组在肠道组织学指标没有显著性差异(P>0.05)3讨论大菱鲆幼鱼对精氨酸的需求量的研究表明,以特定生长率为判定指标大菱鲆幼鱼对饲料中精氨酸的适宜需要量为饲料干重的3.13%[12]我们以此为依据在饲料中设计了三种精氨酸添加水平,分别为精氨酸缺乏的LA饲料,精氨酸适宜的MA饲料和精氨酸过量的HA饲料经过八周的养殖实验,我们测定了饲料中精氨酸水平对大菱鲆生产性能和饲料利用的影响结果显示,精氨酸缺乏显著降低了大菱鲆鱼体末重(FBW)、增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料效率(FER)和蛋白质效率(PER)在饲料中添加适量的晶体精氨酸,鱼体的生长和饲料利用情况显著改善然而,当饲料中精氨酸过量时,鱼体的生长受到抑制此类现象还出现在其他多种鱼类上,如团头鲂(Megalobrama amblycephala)[13]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[14]、金昌鱼(Trachinotus ovatus)[7]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[15]和青石斑鱼(Epinephelus awoara)[16]。

这些结果表明精氨酸在大菱鲆幼鱼的生长和营养利用上发挥着重要作用,在饲料中适量地补充晶体氨基酸有利于大菱鲆的生长和饲料利用另外,饲料中精氨酸水平也影响鱼体组成饲喂HA饲料的鱼体表现为较低的粗脂肪含量相似的结果也出现在团头鲂(Megalobrama amblycephala)[17]和黑鲷(Sparus macrocephalus)[18]上精氨酸降低鱼体脂肪含量的作用可能与精氨酸的重要代谢产物一氧化氮(NO)有关在哺乳动物上的研究发现NO有调节脂肪和葡萄糖代谢的作用,NO可。

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