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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑蛋白质分离纯化的步骤 蛋白质分开纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分开提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的自然状态，不流失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简朴便当，但要留神那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4.
2、 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要参与外观活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜布局破坏，利于蛋白质与膜分开。在抽提过程中，应留神温度，制止强烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分开开来。对比便当的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异举行的分开。常用的有以下几种方法：
3、 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分开。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调理盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其自然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外， 有机溶剂会破坏蛋白质外观的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要留神在低温下操作，选择适合的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分开纯化 用等电点沉淀法、盐析
4、法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分开提纯才能得到有确定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。 卵清蛋白分开提取及纯化的概括试验步骤 一、测验目的与原理 鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有猛烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。 由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有猛烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。 二、材料与试剂： 1材料：崭新鸡蛋2只
5、2：仪器：抽滤瓶5001000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3：试剂： 10TCA，用固体NaOH调调PH至1.051.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 三、操作步骤 1，取两只崭新鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴2530，在不断搅拌条件下，缓慢参与等体积得三氯乙酸丙酮（1:2V/V），立刻展现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5，再持续搅拌30min，然后在4冰箱中放置过夜
6、。 2,次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。 3，边搅拌边参与4预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4放置2h之后将上清液提防倒入瓶中回收，下部沉淀片面于4000rpm离心5min，收集沉淀。 4，将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min ,去除不溶物。 抗菌蛋白分纯的步骤 打定试剂：异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。 操作步骤： 1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2812000g离心10分钟弃上清。 2.用含0.3M
7、盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，287500g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。 3.真空抽干蛋白质沉淀510分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50温浴使其完全溶解，不溶物2810000g离心10分钟除去。分开得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20保存备用。 留神事项： 1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中28一个月以上或-5至-20一年以上。 2.用0.1% SDS在28透析三次，10000g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。 常见
8、问题分析： 得率低： A.样品裂解或匀浆处理不彻底。 B.结果得到的蛋白质沉淀未完全溶解。 蛋白质降解：组织取出后没有连忙处理或冷冻。 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。 球蛋白分开，纯化,鉴定的方法（包括原理，步骤，预期结果，留神事项） 原理 血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白，其中-球蛋白含量约占16，100ml血清中约含1.2g左右。 首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而举行沉淀分开，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白那么仍溶解在溶液中，经离心分开,沉淀片面即为含有-球蛋白的粗制
9、品。 用盐析法分开而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会阻力蛋白质进一步纯化，因此首先务必去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本测验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达成去盐的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可举行分开。球蛋白、-球蛋白的PI6.0；球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基
10、氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱举行层析时，带负电荷的球蛋白和-球蛋白能与DEAE纤维素举行阴离子交换而被结合；带正电荷的球蛋白那么不能与DEAE纤维素举行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有球蛋白，从而使球蛋白粗制品被纯化。其回响式如下： 用上述方法分开得到球蛋白是否纯真，单一？可将纯化前后的球蛋白举行电泳对比而鉴定之。 操作 (1)盐析中性盐沉淀：取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000rmin离心10min。提防倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中参与0.
11、0175molL磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.51.Oml使之溶解。此液即为粗提的球蛋白溶液。 (2)脱盐凝胶柱层析 装柱 洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口参与层析柱内，开启柱底部出口，调理流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液逐渐流下而平匀沉降到层析柱底部，结果使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中留神不能让凝胶床外观露出液面并防止层析床内展现“纹路”。在凝胶外观可盖一园形滤纸，以免参与液体时冲起胶粒。 上样与洗脱：可以在凝胶外观上加圆形尼龙滤布或滤纸使外观平整，提防操纵凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床外观，
12、关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，提防缓慢加到凝胶床外观。开启下端出口，将流速操纵在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，提防参与少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。开启下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可参与适量缓冲液开头洗脱。 加样开头应立刻收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用片面收集器收集，每管1ml。 洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的依次每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20磺基水杨酸溶液2滴，展现白色混浊或沉淀即示有
13、蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以查看NH4+展现的处境。 合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。 (3)纯化DEAE纤维素阴离子交换层析：用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175molL磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布处境。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。 (4)浓缩经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的球蛋白液往往浓度较低。为 8
