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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑酵母双杂试验 pGBKT7和pGADT7不要同时转入细胞，要先转入一个，平板培养，挑单菌落做液体培养，再转入另一个质粒，同时转入两个质粒的效率太低。我做的时候转化率很高，从来没有展现过问题，转入第一个质粒（pGBKT7）通常在SD-Trp平板上可以有3000-4000个菌落，再转入pGADT7后，在双选择平板SD-Trp-Leu上至少也可以收获400-500个菌落。需要留神的是，细胞转入pGBKT7后，在-Trp上挑拣单菌落做液体培养时，不要用YPD培养液，要用SD-Trp培养液，这样才可以使转化的细胞充分生长。 转化测验的条件也很重要，假设你觉得这中间有什
2、么不放心，你可以把protocol发给我看看。我这里AH109长得很好，但测验室在国外，估计没法给你。 另外，你说AH109培养不好，是在什么选择平板上？在转完两个质粒以后做测验筛选时，理应先做LacZ和MEL1的显色，再做HIS3，结果做ADE2（由于ADE2的选择是最stringent的）。还有什么问题可以持续问我。 1.YPDA配制方法如下： 先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ， 加水885ml/L 另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，（假设量不多，也可以用50ml离心管）加水定容至100ml。 以上两个瓶子同时灭菌：115摄氏度
3、，20min 。 灭菌完后，再混合。结果参与已经过滤除菌的0.2的ADE储液，15ml/L 。 121 15min -80取菌种，划线，30 培养3天, 外观光滑而润湿，把平板用封口膜封好，4冰箱保存，防止霉菌污染。 2.设置阴性对照最好用空载体，由于pGBKT7-Lam+pGADT7-T组成的阴性对照，在SD-Trp-Leu-His 板 上是能够生长的，但生长速度要比阳性对照慢好多。而Y187或AH109空菌株，在SD-Trp-Leu-His 板上不能生长，这说明，阴性对照在三缺板上有背景生长。 常用试剂的配制 (1) Kana ( 50rng/ml)溶液的配制:2.5g卡那霉素溶于40 m
4、l双蒸水中,待完全 溶解后定容到50 ml, 0.22011滤膜过滤除菌,-2(rC保存. (2) Amp(100rng/ml)溶液的配制:5g氨节青霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全溶 解后定容到50 ml, 0.22m滤膜过滤除菌,-201保存. (3) 20%葡萄糖溶液的配制:20g葡萄糖溶于40ml去离子水中,待葡萄糖完全溶 解后定容至100ml,在超净工作台中用0.22011滤膜过滤除菌,4C保存。 (4) 0.2%腺噪呤半硫酸盐:0.03g腺嘿呤半硫酸盐溶于12ml去离子水中,待完 全溶解后定容至15ml,在超净工作台中用0.221111滤膜过滤除菌,4C保存。 (5) 60%甘油
5、的配制:60ml甘油,加人去离子水,定容到100ml,混匀后,121 C高温蒸汽灭菌20min,4C保存。 (6) Tris-乙酸(TAE)的配方: 50X储存液:242g Tris 碱+57.1 ml 冰乙酸+100ml0.5inol/LEDTA(pH8.0) 工作液:40mmol/L Tris-乙酸+lmmol/LEDTA YPD培养基 20g/L Difco peptone lOg/L Yeast extract 20g/L Agar(for plates only) 对于包含腺嚼呤的YPD (YPDA)培养基,每升培养基中可参与15ml0.2%的腺 噪呤半硫酸盐溶液(终浓度为0.003
6、%)。 加水至900 ml,调pH值为6.5,然后高温蒸汽灭菌。待培养基冷却到55C左右 时参与100ml20%浓度D-葡萄糖溶液至终浓度为2%。 若向YPD或YPDA培养基中加kan等抗生素,可在高温蒸汽灭菌后待培养基冷 却到55C左右后参与0.2-0.3 ml50mg/ml的kan(终浓度为10-15mg/ml)。 SD培养基 6.7g/L YNB(无氨基酸) 20g/L 琼脂粉(用于固体培养基) 800 ml 双蒸水 100 ml 灭过菌的10X缺失培养基 调pH值到5.8,然后高压蒸汽灭菌。待培养基冷却到55C左右后再参与3-AT, 放线菌酮素,腺嘿呤或X-a-Gal等。 参与100
7、ml灭过菌的20%浓度D-葡萄糖溶液至终浓度2%。 酵母菌遗传转化溶液的配制 (1)PEG3350(50%W/V)的配制:取50gPEG3350,参与35ml双蒸水,磁力搅拌到其 溶解,定容到100ml,混勻,用0.45un滤器过滤除菌,存于灭过菌的容器中,4C保存。 (2)10XTE:10mM EDTA, 0.1M Tris-HCU周 pH 值为 7.5,高温蒸汽灭菌,4C保存。 (3)10X LiAC:lM醋酸锂,用稀醋酸调pH值为7.5,高温蒸汽灭菌,4C保存。 (4) 1 XTE/LiAC( 10ml): 1 m 110XTE+1 ml 10x LiAC+8mlddH20,现用现配。
8、(5)PEG/LiAC溶液的配制:配方见表3. 表3 PEG/LiAC溶液的配方 PEG/LiAC溶液成分 lOmlPEG/LiAC溶液各成分用量 PEG3350 (50%) 8ml 10xTE 1ml 10 x Li AC 1ml 现用现配,用前将其充分混勻。 (6)鲑精DNA ( lOmg/ml)的配制:0.2g鲑精DNA溶于20ml去离子水中,1ml 移液器反复吹打使其断裂,分成小份,-2(rC冷冻保存。用前将其置于沸水浴煮 5分钟,然后急速置于冰浴中2分钟,如此重复3次,使鲑精DNA充分变性。 (7)X-a-Gal (20mg/ml)的配制:0.4g X-a-Gal 溶于 20mlDM
9、F 中,配成浓度为 20mg/ml的储存液,0.22im滤膜过滤除菌,分装成小份,-2(rC避光保存。 (8) 10x氨基酸母液的配制,各成分用量如表4所示。 片段基因酶切产物及对应载体的酶切产物分别举行琼脂糖凝胶电泳分开纯化,然后将目的条带切胶回收,利用DNA凝胶回收试剂盒举行回收。 目的片段与对应载体的连接遵循摩尔比为3:1的原那么,基因片段的回收产物与载体片段的回收产物的概括用量取决于基因片段与载体的大小及其回收产物的浓度。 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 阳性克隆的鉴定，挑取单克隆，摇菌，PCR，4度保存，凝胶检测。 摇菌：从LB平板上挑单菌落接种于10ml含kan抗生素的LB液体培养基中,37C,200rpm,培养 12 -16h，提质粒，-20度保存。 将菌落PCR验证的阳性克隆接种于5mlLB (含50mg/inl kan或含lOOmg/mlAmrp)液体培养基中,37C,180rpm,过夜培养。提取质粒举行酶切鉴定。 酶切体系的电泳检测:将酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 酵母菌AH109养分型测试 用接种环从Yro平板上挑取单克隆,分别接种到SD/-Ura, SDZ-Ade, SD/-His,SD/-Met, SD/-Leu, SD/-Trp和YPDA固体平板上,3(rC倒置培养3-5天,查看菌体生长处境。 6
