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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑酶促反应动力学实验 酶动力学综合测验 测验（一）碱性磷酸酶Km值的测定 【目的要求】 1.了解底物浓度对酶促回响速度的影响 2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。 【测验原理】 1、碱性磷酸酶： 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本测验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程： Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促回响速度的定量关系时，导出了酶促回响动力学的根本公式，即： 错误！未找到引用源。 (1) 式中：v表示酶
2、促回响速度， 错误！未找到引用源。表示酶促回响最大速度， S表示底物浓度， 错误！未找到引用源。表示米氏常数。 3、 错误！未找到引用源。值的测定主要采用图解法，有以下四种： 双曲线作图法（图1-1，a） 根据公式（1），以v对s作图，此时1/2错误！未找到引用源。时的底物浓度s值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，由于在测验条件下的底物浓度很难使酶达成饱和。实测错误！未找到引用源。一个近似值，因而1/2错误！未找到引用源。不精确。此外由于v对S的关系呈双曲线，测验数据要求较多，且不易绘制。 Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b） 实际工作中
3、，常将米氏方程（式（1）作数学变换，使之成为直线形式，测定要便当、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式： 错误！未找到引用源。 (2) 以错误！未找到引用源。对错误！未找到引用源。作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距为错误！未找到引用源。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为错误！未找到引用源。 Hofstee作图法（略） 把（2）式等号两边乘以错误！未找到引用源。，得： 错误！未找到引用源。 (3) 以v对错误！未找到引用源。作图，这时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距 为错误！未找到引用源。，横截距为错误！未
4、找到引用源。 Hanas作图法（略） 把（2）式等号两边乘以S,得： 错误！未找到引用源。 (4) 以 对s作图，这时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距为错误！未找到引用 源。 （a） (b) 本测验主要以双倒数法，即Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。概括原理如下： 本测验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适合条件下（PH10.0，和60），切实回响13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。在确定条件下色泽深浅与光密度成正比。回响式如下： 然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶回响速度，
5、即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。 【仪器与试剂】 仪器： 1. 恒温水浴 2. 721型分光光度计 试剂： 1 酚试剂：称钨酸钠（错误！未找到引用源。W错误！未找到引用源。2错误！未找到引用源。O）100g，钼酸钠（错误！未找到引用源。Mo错误！未找到引用源。2错误！未找到引用源。O）25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再参与硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴
6、数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可持续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，结果酸度为1N。 2 2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2?2H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。 3 碱性缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml. 4 碱性磷酸酶液：称取碱
7、性磷酸酶1mg,加水34ml，冰箱内可保存五周左右。 【测验步骤】 取6支试管按下表参与试剂： 1 2 3 4 5 6 2.5mM磷酸苯二0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 钠（ml） 蒸馏水（ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 - 0.1 碱性缓冲液1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （ml） 混匀后，60欲温5分钟 碱性磷酸酶液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - （ml） 混匀后，60水浴13分钟（切实计时） 留神：1）参与碱性磷酸酶液要快速、切实。用移液枪加 2）此时为酶促回响，总体积2.1ml 3）第六管不加酶。 酚试剂（ml） 1.0 1.0 1.
8、0 1.0 1.0 1.0 10%Na2CO3(ml3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 ) 混匀后，室温放置15分钟 留神：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故参与酚试 剂后酶促回响即中断。 2）Na2CO3 供给碱性环境，参与Na2CO3 后试剂才显色 以6管为调零点，在620nm波优点比色。 【结果处理】 1 将各管光密度和底物浓度记入下表 管号 O.D 1/O.D S 1/S 1 2 3 4 5 2以1/O.D为纵坐标，1/s为横坐标，按Lineweaver- Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km值。 【留神事项】 1） 参与碱性磷酸酶的量要切实 2） 保温时间要切实 切实
9、保温的方法：从第一管参与酶液开头计时，每隔1分钟向下一只试管加酶液,直至加完，到切实13分钟立刻向第一管加酚试剂，以终止其回响，并每隔1分钟向下一只试管加酚试剂,直至加完止，这样保证每管切实保温13分钟。 【斟酌题】 1） Km 的意义及其影响因子 2） 为什么酶促回响速度以初速度表示 3） 为什么O.D可直接代替V作图 4） 分析自己的测验数据 测验（二）温度对酶活性的影响 【测验目的】 了解温度对酶活性及酶促回响速度的影响，加深对酶特性的熟悉。 【测验原理】 每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久流失；而若处于极低温度的环境
10、中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适合，酶又会全部或片面的恢复其活性。 【仪器与试剂】 仪器： 1冰箱 2.恒温水浴锅 3.试管和试管架 4吸量管及吸量管架 5.移液枪及枪头 6.胶头滴管 7烧杯 试剂： 1PH6.8的缓冲液：量取15.45ml的0.2M磷酸氢二钠和4.55ml的柠檬酸混合摇匀即可。 20.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml蒸馏水（需加热）。 3003175g/L碘液 41M HCl溶液 5.1M NaOH溶液 6.稀释100倍的唾液 7.冰水浴 【测验步骤】 1制管和预温 由于本测验对恒温回响要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，
11、分别标记为A管和B管，同时欲温底物与酶。A管参与PH6.8的缓冲液和0.5%淀粉液；B管使用移液枪参与稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温5min。 取12支清白试管，参照下表参与试剂： 管号 1（0） 2（室温） 3（37） 4（50） 5（70） 6（室温） PH6.8的2 2 2 2 2 2 缓冲液（ml） A 含NaCl用2ml的0.5%2 2 2 2 2 的蒸馏淀粉液水代替 （ml） 稀释100B 倍的唾1 1 1 1 1 1 液（ml） *6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水代替 2混合A、B管 将1号A管试剂急速参与温度对应的B管中(
12、为了最大限度保证酶的量)，此时为计时的起点（使用秒表），摇匀后放回对应温度持续水浴。留神：转移A管试剂前需将其摇匀。 3时间操纵 然后每隔1min或2min（时间自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6号的A、B管混合 ，严格操纵好时间。 4中止回响 切实回响13min，向1号管参与2滴1M HCl溶液，立刻混匀，中止回响，按上一步的依次和时间间隔依次对各管举行操作，并移至试管架。后再各用2滴1M NaOH溶液中和每管。 5显色 在每管中各参与2ml 0.03175g/L碘液并混匀，查看现象。 6比色 若不同温度梯度间现象区别不明显，那么举行比色，通过光密度值来对比。 【结果处理】 记录现象（或对比吸光度值），做出合理分析。 【留神事项】 严格留神时间的操纵及各物质的添加量。 【斟酌题】 假设某同学（没有严格按照教案步骤）做出的测验结果为唾液淀粉酶的最适温度为70度，请分析他得出这样的结果的可能理由。 8
