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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑质粒DNA的提取 质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定 李笃财 生科 1班 202200140048 【测验目的】 1、掌管碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌管碱变性法提取质粒DNA的方法。 3、学习并掌管凝胶电泳举行DNA分开纯化的测验原理。 【测验原理】 1. 质粒DNA的提取碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法好多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简朴，易于操作，一般测验室均可举行。提取质粒DNA纯度
2、高，可直接用于酶切、序列测定及分析。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个根本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分开和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋布局存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所凭借的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋布局解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大片面氢键断裂，但两条互补链不完全分开。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调理碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋布局而溶解于溶液中；但染色体D
3、NA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分开。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，裁减DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝结而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，结果获得纯度较高的质粒DNA。 2.质粒DNA抽提过程中各试剂成分及作用： 溶液：由葡萄糖、EDTA、Tris?HCl组成.(养护、缓冲) 葡萄糖可增加溶液的粘度,裁减
4、抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒. EDTA 络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 Tris?HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围，起缓冲作用。 溶液II：由SDS与 NaOH 组成(裂解、变性) SDS可裂解细胞、使蛋白质变性。 NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性。 溶液III：HAc(乙酸)和 KAc(乙酸钾)组成的高盐溶液(复性，分开) HAc溶液能中和溶液的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子
5、而与小分子质粒DNA分开。 冰乙醇：夺取多余的水分。 3.凝胶电泳举行DNA分开纯化： 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在确定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以识别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分开、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。 琼脂糖加热至90左右，即可溶化形成清亮、通明的液体，浇在模版上冷却
6、后形成凝胶，其凝固点为40-45。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶辨识率低，但它的分开范围更大(50至百万bp)，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分开。 琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。 【测验步骤】 1、菌体的培养 1、配制LB液体培养基：1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，NaOH调pH至7.2，121
7、高温灭菌15min。 共配1L，分装至：20ml8瓶，100ml三角瓶；80ml8瓶，300ml三角瓶；50ml4瓶，300ml三角瓶。分别参与1.5%琼脂粉。 2.打定：dd H2O:40ml/300ml三角瓶，2瓶；200L、1000L枪尖各一盒；50mL离心管2个；1.5mL离心管若干（装在500mL锥形瓶中）；一瓶牙签。包装灭菌备用。 3.在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取一环携带有质粒pUC19的E.coliDH5单菌落，接种于20mL含有氨苄青霉素含量为100g/mL的LB液体培养基中，37振荡过夜培养。 4.取过夜培养物2-3mL，接种到50mL含有氨苄青霉素含量为100g/mL的
8、LB液体培养基中，培养4-6h。 2.质粒DNA的提取： 1.称量50mL离心管重量W1，取30mL菌液于已称重的50mL离心管中，配平后6000r/min离心5min。 2.弃上清，向离心管中参与5mL溶液，涡旋振荡，6000r/min离心5min。 3.弃上清并称重W2，求W=W2-W1。 4.按照1.0mL/100mg菌体的量参与溶液，充分涡旋振荡，冰浴5min，再按照2.0mL/100mg菌体的量参与溶液，温柔颠倒混匀，冰浴2min，然后再按照1.5mL/100mg菌体的量参与溶液，温柔颠倒混匀，冰浴10min，平衡后12000r/min离心15min。 5.取上清至新50mL离心管内
9、，记录体积，参与两倍体积的冰乙醇，混匀后 在-20环境下保存30min。取出后12000r/min离心15min，弃上清，参与5mL70%乙醇，12000r/min离心5min，弃上清，重复一次，弃上清，37风干5-10min。 6.取出离心管，参与1mLTE溶液得到粗提物，参与50l RNase A（10mg/ml），使溶液浓度为50g/mL，37保存60-120min。 3.质粒DNA的纯化： 1.取500l粗提物于1.5mL离心管中，参与等体积的Tris饱和酚，混匀，12000r/min离心5min。 2.转移上清（体积V1）至新管，参与等V1的酚：氯仿：异戊醇溶液，混匀，12000r/
10、min离心5min。 3.转移上清（体积V2）至新管，参与等V2的氯仿：异戊醇溶液，混匀，12000r/min离心5min。 1 4.转移上清（体积V3）至新管，参与 V3的3M NaAc溶液（pH5.2），再参与2V4 10 1 （V4=V3+ V3）的冰乙醇，混匀，-20保存30-60min，取出后12000r/min离心 10 15min。 5.弃上清，参与500l 70%乙醇，10000r/min离心2min，重复洗涤一次。37风干5-10min。 6.取出离心管，向一只离心管中参与30l TE溶液，溶解沉淀后，将溶液全部转移入另一只离心管中，得到30l纯化质粒DNA。 4.DNA纯度
11、检测琼脂糖凝胶电泳： 1.1%琼脂糖凝胶的制备： 用50TAE制备5L 1TAE；取40ml 1TAE至300ml明净锥形瓶中，称0.4g琼脂糖，倒入三角瓶混匀，轻塞棉塞，微波炉加热沸腾3-4次，至澄清无颗粒；冷却至60左右，倒入制胶槽中，冷却凝固待用。 2.点样：待胶凝固后，提防拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内参与1TAE 电泳缓冲液，至液面笼罩过胶面1-2mm。取2.0l纯化DNA+2.0ldd H2O+1.0l上样缓冲液（6loading buffer），混合。用移液枪吸取5.0l垂直参与点样孔中。 3.电泳：100V，200mV条件下电泳30min左右。 4.EB染色：
12、提防从电泳槽中取出凝胶；参与0.5g/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10min，期间轻轻晃动盛EB溶液的盘子2-3次；用X光片提防端起凝胶，沥去多余的液体，转移至去离子水中漂洗10min，期间轻轻晃动盘子2-3次；用X光片提防端起凝胶，沥去多余的液体；用凝胶成像仪拍照，得到测验结果。 【测验结果】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 DNA纯度检测凝胶成像结果 【测验分析】 电泳图中，从左边起，第1组为商品化的超螺旋marker，其次组为pUC19质粒, 第三组为被HindIII酶切过的 pUC19质粒。第8组是我们的点样。从电泳图上来看
13、，点样较明显，点样处亮度不明显，除质粒DNA外中间没有明的染色体DNA的条带，说明我们的杂质去除效果还算梦想。从图中可以看出，分子片段小的电泳跑的远，这是由于凝胶是一种分子筛，小片段受到的阻碍作用小，因此能够移动的距离就远，片段越大受到的阻碍越大，不轻易移动。因此在结果的结果中，三种质粒DNA从下往上的依次为超螺旋质粒DNA、线性质粒DNA、开环质粒DNA。我们组的质粒DNA条带较亮，说明纯度较大，而且条带较宽，说明在提取过程中损失不多，结果留存了较多的质粒DNA。与第一组的超螺旋marker对比得出，我们的质粒DNA片段大小正常。与其次组的pUC19条带相比，虽然我们的线性DNA与开环DNA
14、之间的分开不是很明显，但是专心看还是能看出来的，所以我们的结果还是算可以的。 【留神事项】 1提取过程应尽量在低温环境中举行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取屡屡抽提尽量将蛋白质除明净，在沉淀DNA 时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。同时回响中参与的盐浓度确定要操纵好，当参与的盐溶液浓度太低时，只有片面DNA形成DNA钾盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当参与的钾溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等回响，务必要举行洗涤或重沉淀。一般处境下都是参与的最终浓度达0.10.25mol/L为宜。 2该测验告成的标志
15、是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除明净，获得确定的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难，由于在全部提取过程中，只 有一次机遇去除染色体DNA，其关键步骤是参与溶液与溶液时，操纵变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒DNA相分开。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液参与时可用力振荡几次，由于此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必惦记其分子断裂，参与SDS后，那么要留神不能过分用力振荡，温柔混匀,但又务必让它回响充分。参与溶液II混匀之后,确定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理! .3、参与溶液I之前,留神将离心管倒扣过来,将培养基完全流出. 4、加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动45次，留神查看水相与乙
