本文格式为Word版，下载可任意编辑高效毛细管电泳实验 高效毛细管电泳测验 一、测验目的 1. 进一步理解毛细管电泳的根本原理； 2. 熟谙毛细管电泳仪器的构成； 3. 了解影响毛细管电泳分开的主要操作参数 二、测验原理 1．电泳淌度 毛细管电泳（CE）是以电渗流 (EOF)为驱动力，以毛细管为分开通道，依据样品中组分之间淌度和调配行为上的差异而实现分开的一种液相微分开技术离子在自由溶液中的迁移速率可以表示为： ? = ?E （1） ??q 6??r （2） 式中?是离子迁移速率，?为电泳淌度，E为电场强度为介质粘度，r为离子的流体动力学半径，q为荷电量因此，离子的电泳淌度与其荷电量呈正比，与其半径及介质粘度呈反比 2．电渗流和电渗淌度 电渗流（EOF）指毛细管内壁外观电荷所引起的管内液体的整体滚动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用 在水溶液中多数固体外观根据材料性质的不同带有过剩的负电荷或正电荷就石英毛细管而言，外观的硅羟基在pH大于3以后就发生明显的解离，使外观带有负电荷。
为了达成电荷平衡，溶液中的正离子就会聚集在外观邻近，从而形成所谓双电层，如图1所示这样，双电层与管壁之间就会产生一个电位差，叫做Zeta电势但毛细管两端施加一个电压时，组成分散层的阳离子被吸引而向负极移动由于这些离子是溶剂化的，故将拖动毛细管中的体相溶液一起向负极运动，这便形成了电渗流 电渗流的大小可用速率和淌度来表示： ?EOF????/??E ?EOF???/? （3） 或者 （4） 式中?EOF为电渗流速率，?EOF为电渗淌度，?为Zeta电势，?为介电常数 3．毛细管电泳的分开模式 CE有6种常用的分开模式，其中毛细管区带电泳（CZE）、胶束电动毛细管色谱（MEKC）和毛细管电色谱（CEC）最为常用本测验的内容为CZE 4．毛细管电泳的根本参数 1 CE中的分析参数可以用色谱中类似的参数来描述，譬如与色谱留存时间相对应的有迁移时间，定义为一种物质从进样口迁移到检测点所用的时间，迁移速率（?）那么是迁移距离（l，即被分析物质从进样口迁移到检测点所经过的距离，又称毛细管的有效长度）与迁移时间（t）之比： ??lt （5） 由于电场强度等于施加电压(V)与毛细管长度(L)之比： E?VL （6） 就CE的最简朴的模式—毛细管区带电泳（CZE）而言，结合式（1），可得： ?a?llL?tEtV （7） 在毛细管区带电泳(CZE）条件下测得的淌度是电泳淌度与电渗流淌度的矢量和，我们称之为表观淌度?a，即： ?a??e??EOF （8） 测验中可以采用一种中性化合物，如二甲亚砜或丙酮等，来单独测定电渗流淌度，然后求得被分析物的有效淌度。
三、仪器及试剂 HP3D电泳仪5 mL移液管2只，1mL 移液管共2支，分别标上四种标样的标签10 mL容量瓶2个，滴管2支，分别标上标准、未知的标签 塑料样品管若干个，分别用于标准样品、未知样品、三种缓冲溶液、HCl、NaOH、二次水和废液，做好标号微量自动移液枪，酸度计 标样：苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸，均溶于二次水中，浓度1.00 mg/mL，作为标准品，混合稀释作为标样另有一个预先配制的未知浓度混合样品 缓冲溶液(buffer)：10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4 1:1缓冲溶液(NaH2PO4和Na2HPO4各5mMol/L)，20 mmol/L HAc-NaAc pH为6 (HAc:NaAc大约1:15)缓冲溶液，20 mmol/L Na2B4O7缓冲溶液 0.1mol/L NaOH溶液，二次去离子水 四、测验步骤 1. 仪器的预热和毛细管的冲洗：在测验教师的指导下，开启仪器和配套的工作站工作温度设置为30℃，不加电压，冲洗新毛细管，依次依次是：1 mol/L HCl溶液30 min二次水5 min ，1 mol/L NaOH溶液30 min，二次水5 min，10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4 1:1缓冲溶液5 min，两次运行之间依次用0.1 mol/L NaOH 2min, 二次水2 min, 缓冲液5min。
2 2. 混合标样的配制：毛细管冲洗的同时，配制混合标样分别用5mL的移液管移取3mL苯甲醇、3mL苯甲酸，用1mL的移液管移取1mL水杨酸、0.5mL对氨基水杨酸于10mL的容量瓶中，定容，得到苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸浓度分别为300μg/mL、300μg/mL、100μg/mL、50.0μg/mL的混合溶液作为混合标样试斟酌为什么不采用浓度一样的混合溶液作为混合标样？） 3. 混合标样的测定：待毛细管冲洗完毕，取50μL混合标样，置于塑料样品管，放在电泳仪样品盘（Tray）中，进样压力50 mbar，进样时间5 s然后开头分析，电压25 kV 4. 未知浓度混合样品的测定：方法与条件同上，测试未知浓度混合样品， 5. 不同缓冲溶液下迁移时间的变化：未知浓度混合样品的测定完毕后，冲洗毛细管，依次依次是：0.1 mol/L NaOH溶液5 min，二次水5 min，然后更换缓冲溶液为20 mmol/L Na2B4O7，冲洗5 min；并在此条件下测试未知浓度混合样品，电压25 kV按照前面的依次再次冲洗毛细管，再次更换缓冲溶液为20 mmol/L HAc-NaAc pH为6，冲洗5 min；并在此条件下测试未知浓度混合样品，电压25 kV。
6. 完成测验以后，用0.1 mol/L NaOH冲洗毛细管10 min, 二次水冲洗5min 7. 打印报告，清理测验台 五、数据处理 1. 根据电泳的原理，判断两组混合标样中4个峰各自的归属(需要查找被分析物的pKa值)，找到在未知浓度混合样品中与之迁移时间一致的峰 2. 按照已知浓度峰的积分面积之比折算未知浓度混合样品中各个组分的浓度（外标定量法） 3. 计算各个组分的表观淌度和有效淌度，并说明哪个组分可以作为电渗流标记物本次CE测验使用的毛细管总长度L＝56cm，有效长度l＝50cm 4. 根据电泳的原理，判断在另外两种缓冲溶液下，各个峰的归属，并对各个组分迁移时间的变化做出合理分析和议论 六、留神事项 1. 冲洗毛细管时遏止在毛细管上加电压；不允许更改讲义上给定的工作电压，也不建议变更进样时间 2. NaOH、HCl、二次水、样品和缓冲溶液等之间的切换是自动的，在测验过程中要随时留神是否放在Tray正确位置 3. 冲洗毛细管对于测验结果的稳当性和重现性至关重要，务必专心完成每一次冲洗，不允许缩短冲洗时间或者不冲洗 4. 做完测验以后确定要用水冲洗毛细管，否那么可能会导致毛细管堵塞，严重影响测验结果，梦想引起足够的重视。
5. 塑料样品管的里面轻易产生气泡，小扣管壁排出气泡以后面可放入样品盘(Tray) 3 6. 合理调配测验时间，留神一组的四个同学之间的分工合作，每个同学均要实际操作冲洗、进样、分析全过程一次 4 — 7 —。