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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑高效液相色谱方法建立 一般处境下，HPLC分开方法的建立遵循以下步骤： (1)了解样品的根本处境 所谓样品的根本处境，主要包括样品所含化合物的数目、种类(官能团)、分子量、pKa 值、UV光谱图以及样品基体的性质(溶剂、填充物等)、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。 (2)明确分开目的 是分析组分还是制备样品； 是否已知样品全体成分的化学特性，或是否需做定性分析； 是否有必要解析出样品的全体成分(譬如对映体、非对映体、同系物、痕量杂质)； 如需做定量分析，细致度需多高； 建立的方法将适用几种样品分析还是大量种样品分析； 将使用最终方法的常规测验室
2、中已有哪些HPLC设备和技术。 (3)了解样品的性质和需要的预处理 除非样品是适于直接进样的溶液，否那么，高效液相色谱分开前均需举行某种形式的预处理。有的样品需参与缓冲溶液以调理pH值；有的样品含有干扰物质或“损柱剂”而务必将其去除。此外，为了保证最终的样品溶液与滚动相的成分尽量相近，最好用滚动相溶解(或稀释)样品。 (4)检测器的选择 不同的分开目的对检测的要求不同，如测单一组分，梦想的检测器应仅对所测成分响应，而其他任何成分均不出峰。另外，假设目的是定性分析或是制备色谱，那么最好有通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分。仪对分析而言，检测器灵敏度越高，最低检出量越小越好；假设目的是用
3、作制备分开，那么检测器的灵敏度没必要很高。 应尽量使用紫外检测器(UV)，由于目前一般的HPLC都配有这类检测器，它便当且受外界影响小。如被测化合物没有足够的UV生色团，那么应考虑使用其他检测手段： 如示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器等。假设实在找不到适合的检测器，才可以考虑将样品衍生化为有UV吸收或有荧光的产物，然后再用UV或荧光检测。 (5)分开模式的选择 在充分考虑样品的溶解度、分子量、分子布局和极性差异的根基上，确定HPLC的分开模式。 (6)固定相和滚动相的选择 在实际分析过程中，确立了分开模式之后，选择适合的固定相与滚动相是特别重要的。下面简朴议论几种常见液相色谱法的固定相
4、与滚动相的选择。 A硅胶吸附色谱 在硅胶吸附色谱中，对留存值和选择性起主导作用的是溶质与固定相的作用，滚动相的作用主要是调理溶质的留存值在确定范围内。在吸附色谱中，滚动相的弱组分是正己烷，实际过程中，可根据溶质所包含的官能团信息，选择适当的滚动相的强组分。 样品中只含有一OH、 COOH、-NH2这类质子赋予体基团时，可选用异丙醇作为滚动相的强组分； 样品中的溶质中含有一C00一、一CO一、 N02一和一C=O这类质子采纳体的基团时，可选用乙酸乙酯、丙酮或乙腈作为滚动相的强组分； 样品的溶质中只含有一0一和苯基这类极性作用较弱的基团时，可选用乙醚作为冲洗剂的强组分； 样品中若含有规矩、和中两种
5、或两种以上不同类的基团时，可按规矩、和的依次优先选择冲洗剂的强组分； 样品中的溶质同时含有多个一H2PO4、-COOH、-OH和一NH2等氢键力较强的基团时，那么应在规矩选择的滚动相中参与适量的乙醇或乙腈，必要时也可参与水。 B正相键合相色谱 正相键合相色谱分开机理与硅胶吸附色谱好像，滚动相的选择可引用硅胶吸附色谱中的规矩，固定相的选择原那么如下： 若-样品溶质中含有一COO一、-NO2、-CN等具有质子采纳体基团，那么可选用氨基、二醇基这一类具有质子赋予才能的固定相； 若样品溶质中含有NH2、NH、OH、一COOH等具有质子赋予才能的基团，那么可选用腈基、氨基和醇基键合固定相； 若样品中同时
6、包含有规矩与中所示的两类基团，那么可选用规矩中推举的键合同定相。 C反相色谱 在反相色谱中，水是常用的滚动相，C18是常用的填充载体。重要的是选择滚动相的强组分，常用的强组分有甲醇、乙腈与四氢呋喃。反相色谱滚动相的选择规矩如下： 若样品溶质中含有两个以下氢键作用基团(如-COOH、-NH2、-OH等)的芳香烃邻、对位或邻、间位异构体，可选用甲醇水为滚动相; 若样品溶质中含有两个以上C1、I、Br的邻、间、对位异构体或极性取代基的间、对位异构体以及双键位置不同的异构体，可选用苯基或C18键合固定相、乙腈水为滚动相； 当实际过程中获得溶质的k值大于30(一般要求1k20时)，应在反相色谱系统的甲醇
7、水滚动相中参与适量四氢呋喃、三氯甲烷或丙酮，以使被分开溶质的K值保持在适当范围内；当然，也可以通过裁减固定相外观键合碳链浓度或缩短碳链长度来达成减小k 值的目的； 若样品溶质中含有一NH2、NH或N一这一类基团时，应在反相色谱的滚动相中参与适量有机胺以提高样品留存值的重现性和色谱峰的对称性。 D凝胶色谱 凝胶是凝胶色谱的核心，是产生分开作用的根基，举行凝胶色谱测验的重要一环是选择和搭配具有不同孔径的性能良好的凝胶。生物大分子分开的传统方法多采用多糖聚合物凝胶GPC填料，这种填料只能在低压、慢速操作条件下使用，目前在很大程度上已被微粒型交联亲水硅胶和亲水性键合硅胶取代。填料具有确定的孔径尺寸分布，随孔径大小的区别，分开分子量范围为1200万之间。对于测验室分析或小规模制备，平均粒度在313m的填料，一般有良好的柱效和分开才能；但对于大规模制备和纯化，考虑到本金和渗透性，可选用较粗的粒度。实际过程中，往往测验室只配备有确定的色谱柱，因此，色谱分开方法和色谱柱往往是确定的，但对装备齐全的测验室而青，色谱柱的选择还是有意义的。 5
