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1、中和试验【实验目的】掌握中和试验的基本原理及意义；熟悉中和试验的具体操作方法、结果判定标准及计算方法；了解中和试验的注意事项。【实验原理】中和试验有两种方法：1. 用已知的抗体检测未知病毒及其滴度：固定抗血清-稀释病毒法。在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力。2. 已知病毒检测血清中未知抗体及其滴度：固定病毒-稀释抗血清法。中和抗体与病毒结合后，能够使病毒失去吸附、传入宿主细胞的能力，从而阻止了病毒的增殖，使其失去致细胞病变效应，因此在进行病毒中和试验时，首先将病毒与免疫血清在适当条件下混合、孵育，然后将其
2、接种到敏感宿主细胞中进行培养，从而可根据对细胞、动物等的保护效果来判断病毒是否已被中和，并计算出中和抗体的效价。【实验器材】37孵箱、倒置显微镜、CO2培养箱、96孔细胞培养板、微量加样器及无菌吸头、无菌刻度吸管、无菌中试管、无菌平皿、无菌1.5ml EP管。待检血清（0.5ml）、阳性血清、阴性血清。BHK21细胞、新城疫鸡瘟病毒悬液、细胞维持液、Hanks液。【实验方法】固定病毒-稀释抗血清法。1. 待检血清的稀释：取12个无菌EP管，做好标记，无菌条件下每管加入0.5ml维持液，向第1管中加入0.5ml待检血清（稀释度23），混匀后，换一个新枪头，从第1管中取出0.5ml加入第2管中，混
3、匀后，换一个新枪头，再从第2管中取0.5ml加入第3管中，依次类推。倍比稀释，共做12个稀释度。管号123456789101112稀释度22223242526272829210211212维持液（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5待检血清（ml） 0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.52. 阳性对照的稀释：取12个无菌EP管，做好标记，无菌条件下每管加入0.3ml维持液，向第1管中加入0.3ml阳性血清，混匀后，从第1管中取出0.3ml加入第2管中，混匀后，再从第2管中取0.3ml加入第3管中，依次类推。倍比稀释，共
4、做12个稀释度（16，32，64，128，256，512。），同上表。3. 阴性对照的稀释：用阴性血清，稀释同阳性血清。4. 病毒的稀释及与抗体的混合：按病毒的CCID50/0.1ml进行稀释，使每0.1ml含100CCID50/0.1ml病毒量。后续实验大约需要100 CCID50/0.1ml病毒悬液15ml。将滴度为100CCID50/0.1ml病毒悬液加入上述稀释好的待检血清、阳性对照、阴性对照的每个稀释的试管中：待检血清：每管加0.5ml 阳性对照：每管加0.3ml（2人共用） 阴性对照：每管加0.3ml（2人共用）混匀后置37孵箱中作用1h。5. 病毒对照的配制：0.5ml维持液+0
5、.5ml100CCID50/0.1ml。混匀后置37孵箱中作用1h。6. 细胞对照：1ml维持液。置37水浴箱中作用1h。7. 取出事先准备好的长有单层BHK21细胞的96孔板，吸取其中的培养液，用Hanks液（预先调好pH值，加1%双抗）洗一遍。8. 将上述各稀释度的待检血清-病毒混合液（每个稀释度加4孔-A B C D）、阳性血清-病毒混合液（每个稀释度加1孔-E）、阴性血清-病毒混合液（每个稀释度加1孔-F）、病毒对照（加G1G4）、细胞对照（加H1H4）用微量加样器分别加入到细胞培养板各孔内，每孔0.2ml。Ab稀释度116(10-1.2)232(10-1.5)364(10-1.8)4128(10-2.1)5256(10-2.4)6512(10-2.7)71024(10-3.0)820489409610819211163841232768待检血清ABCD阳性对照E阴性对照F病毒对照GVVVV细胞对照HCCCC9. 将96孔细胞培养板放入37 5% CO2培养箱内培养3-5天。每天在倒置显微镜下观察细胞变化，并记录结果。【结果判定】计算50%血清中和终点：见课本第68页【注意事项】342页
