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1、第三章第三章卫生微生物学研究和检测方法卫生微生物学研究和检测方法 1.1.卫生微生物检验与医学微生物检验的区别与特点卫生微生物检验与医学微生物检验的区别与特点 ? ?2.2.样品的采集原则样品的采集原则 ？3.3.影响采样代表性的因素有哪些？影响采样代表性的因素有哪些？4.4.怎样使采样具有针对性？怎样使采样具有针对性？5.5.样品采集后为什么要尽快送检？样品采集后为什么要尽快送检？6.6.怎样保护样品中的待检微生物？怎样保护样品中的待检微生物？7.7.样品中抑菌物质去除方法有哪些？样品中抑菌物质去除方法有哪些？8.8.样品的处理策略（目的）与方法样品的处理策略（目的）与方法9.9.怎样浓缩样
2、品中的微生物？怎样浓缩样品中的微生物？10.10.环境中的微生物数量低，怎样提高检出率？环境中的微生物数量低，怎样提高检出率？11.11.怎样进行卫生安全性评价？怎样进行卫生安全性评价？第一节第一节 卫生微生物学检测特点及基本原则卫生微生物学检测特点及基本原则 一、卫生微生物检测的特点一、卫生微生物检测的特点 检测对象多检测对象多致病微生物致病微生物非致病微生物非致病微生物条件致病微生物条件致病微生物检测范围广检测范围广标本来源多标本来源多人：个体及群体人：个体及群体环境环境健康相关产品健康相关产品检测目的特殊检测目的特殊检测方法灵敏检测方法灵敏浓缩浓缩去除不利因素去除不利因素查明突发公共卫生
3、事件的原因查明突发公共卫生事件的原因（定量测定和分型检测）（定量测定和分型检测）卫生质量监测与安全评价卫生质量监测与安全评价（卫生指示微生物）（卫生指示微生物） indicator microorganism二、卫生微生物检测的基本原则二、卫生微生物检测的基本原则 采集采集保存保存运送运送检测检测基本原则基本原则样品种类样品种类n感染标本感染标本n正常人体标本正常人体标本n卫生样品卫生样品n食品、化妆品、水产品、消毒及卫生用食品、化妆品、水产品、消毒及卫生用品、水、土壤、空气等品、水、土壤、空气等（一）样品的采集原则（一）样品的采集原则n代表性与针对性代表性与针对性n采样部位采样部位n采样方法
4、采样方法n采样时间采样时间n采样的随机性采样的随机性n采样量采样量n采样的注意事项采样的注意事项 n避免外源性污染避免外源性污染 n避免对微生物的杀灭避免对微生物的杀灭作用和引入新的抑菌作用和引入新的抑菌物质物质n注意加入中和剂注意加入中和剂n采样记录采样记录 影响采样代表性的因素影响采样代表性的因素n采样量：采样量：n采样部位：采样部位：n采样时间：采样时间：n避免对微生物的杀灭作用和引入新的抑避免对微生物的杀灭作用和引入新的抑菌物质菌物质（二）卫生样品的运送原则（二）卫生样品的运送原则？1.尽快送检！尽快送检！ 多快？多快？n一般不超过一般不超过34h 为什么？为什么？n减少待测微生物的死
5、亡。减少待测微生物的死亡。n防止微生物的繁殖对计数结果的影响。防止微生物的繁殖对计数结果的影响。（二）卫生样品的运送原则（二）卫生样品的运送原则n1.尽快送检尽快送检n2.注意保护待检微生物注意保护待检微生物n温度、加入保护剂、运送培养温度、加入保护剂、运送培养n氧气、防止溶血氧气、防止溶血n3.注意生物安全注意生物安全n密封，避免泄露密封，避免泄露n4.完善的样品交接完善的样品交接n实验室收样应按送检单逐项核对实验室收样应按送检单逐项核对（三）实验室检验原则（三）实验室检验原则n1、相应的相应的硬件条件和设备硬件条件和设备n2、合格的合格的检验人员检验人员n3、标准标准/公认的公认的检验方法
6、检验方法n4、实验室实验室质量控制质量控制n5、微生物检验优先微生物检验优先1、相应的相应的硬件条件和设备硬件条件和设备n微生物危害度分级微生物危害度分级n致病力、传染性、当地人群的免疫水平、有致病力、传染性、当地人群的免疫水平、有无免疫制剂和特效治疗药物等无免疫制剂和特效治疗药物等n危害等级危害等级：低个体危害，低群体危害：低个体危害，低群体危害n危害等级危害等级：中等个体危害，有限群体危害：中等个体危害，有限群体危害n危害等级危害等级：高个体危害，低群体危害：高个体危害，低群体危害n危害等级危害等级：高个体危害，高群体危害：高个体危害，高群体危害n生物安全防护水平分级生物安全防护水平分级
7、生物安全防护水平生物安全防护水平(BSL)分级分级生物安全防生物安全防护水平护水平BSL-1BSL-2BSL-3BSL-4protect P1P2P3P4实验室的生实验室的生物安全防护物安全防护 ABSL-1ABSL-2ABSL-3ABSL-4n1 1、相应的硬件条件和设备、相应的硬件条件和设备n2 2、具有合格的检验人员、具有合格的检验人员n人员的资质与培训人员的资质与培训n1 1、相应的硬件条件和设备、相应的硬件条件和设备n2 2、具有合格的检验人员、具有合格的检验人员n3 3、标准、标准/ /公认的检验方法公认的检验方法nGBGB、规范等、规范等n没有没有GBGB或部颁标准，按上级或部颁
8、标准，按上级CDCCDC要求要求n1 1、相应的硬件条件和设备、相应的硬件条件和设备n2 2、具有合格的检验人员、具有合格的检验人员n3 3、标准、标准/ /公认的检验方法公认的检验方法n4 4、加强实验室质量控制（、加强实验室质量控制（质量保证体系质量保证体系n样品受理部门样品受理部门n样品检测部门样品检测部门 n出具检验报告的部门出具检验报告的部门n监督检查部门监督检查部门 第二节第二节卫生微生物学研究和检测的方法卫生微生物学研究和检测的方法 学习内容：学习内容：n样品处理样品处理n损伤菌的复苏损伤菌的复苏n增菌与分离增菌与分离n定量计数定量计数n分型鉴定分型鉴定一、样品处理样品处理n均质
9、化均质化n乳化后再行稀释乳化后再行稀释n去除抑菌物质去除抑菌物质n浓缩目的菌浓缩目的菌一、样品处理样品处理n（1）均质、混匀）均质、混匀：n液体样品液体样品n电动混合、手摇混合或敲打、震荡电动混合、手摇混合或敲打、震荡；n固体样品固体样品n灭菌乳钵内研磨均匀、高速组织捣碎机或匀浆器；灭菌乳钵内研磨均匀、高速组织捣碎机或匀浆器；n油性样品油性样品n乳化乳化 + 均质均质n为什么要均质为什么要均质？n有利于取样的代表性有利于取样的代表性n样品内部的待测微生物释放样品内部的待测微生物释放n但混合的时间不宜太长和过猛但混合的时间不宜太长和过猛？一、样品处理样品处理n（1）均质化）均质化n（2）去除抑菌
10、物质）去除抑菌物质n中和法中和法n过滤法过滤法n稀释稀释+过滤过滤一、样品处理样品处理n（1）均质化：）均质化：n（2）抑菌物质去除）抑菌物质去除n（3）浓缩目的菌）浓缩目的菌n沉淀离心法沉淀离心法n过滤法过滤法n吸附沉淀法吸附沉淀法n免疫磁珠法免疫磁珠法 n相应的抗体连接于磁珠相应的抗体连接于磁珠 - 菌体复合物菌体复合物二二、损伤菌的复苏损伤菌的复苏(resuscitation)n为什么要复苏？为什么要复苏？n受冷、热、脱水干燥、辐照、高渗透压或防腐剂、受冷、热、脱水干燥、辐照、高渗透压或防腐剂、消毒剂的作用，可能引起消毒剂的作用，可能引起亚致死性损伤亚致死性损伤n方法方法 n采用采用无选
11、择压力无选择压力培养基培养基增菌增菌n改变培养改变培养温度、时间温度、时间 n先在先在 252537 37 修复修复12 h12 h，在转入选择性培养基，在转入选择性培养基n活菌数测定时，降低培养温度至活菌数测定时，降低培养温度至 30303232 n延长培养时间：延长培养时间：4848h hn在在选择性培养基选择性培养基中加入中加入中和剂中和剂三、增菌与分离三、增菌与分离 n物理方法物理方法 n高温或低温，有氧或无氧，有或无光照高温或低温，有氧或无氧，有或无光照n化学方法化学方法n改变盐的浓度改变盐的浓度n嗜盐菌培养基嗜盐菌培养基n7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤 n加入抑菌剂加入抑菌剂n胆盐、
12、煌绿、多粘菌素胆盐、煌绿、多粘菌素B 等等最常用：选择性增菌与分离最常用：选择性增菌与分离？卫生微生物样品特点：卫生微生物样品特点：目的菌数量低目的菌数量低细菌受损细菌受损杂菌多杂菌多n数量低数量低浓缩浓缩n细菌受损细菌受损复苏复苏n杂菌多杂菌多选择性增菌和选择性增菌和分离分离四、定量计数方法四、定量计数方法n倾注平板计数法倾注平板计数法n表面涂布计数法表面涂布计数法nMPN法法（最可能数法）（最可能数法）n比浊计数法比浊计数法 n显微镜直接计数法显微镜直接计数法 n微菌落快速计数法微菌落快速计数法倾注平板计数法倾注平板计数法n测定样品中细菌、霉菌和酵母测定样品中细菌、霉菌和酵母菌等数量最常用
13、的方法菌等数量最常用的方法nCFU/ml(或或g)n卫生微生物检验基本技术之一卫生微生物检验基本技术之一 稀释稀释注意事项注意事项n稀释、加样要精确稀释、加样要精确n倾注琼脂培养基温度约倾注琼脂培养基温度约 45 左右左右n混匀混匀n23个平行板个平行板n选择适宜系数度计数选择适宜系数度计数n细菌选择细菌选择30300cfu计数计数n霉菌选择霉菌选择30100n要设立空白对照要设立空白对照 n稀释液稀释液+培养基培养基菌落计算方法菌落计算方法n（1）菌落计数方法）菌落计数方法肉眼观查，必要时用放大镜检查，求出各肉眼观查，必要时用放大镜检查，求出各稀释度的平均菌落总数。稀释度的平均菌落总数。平板
14、菌落数的选择平板菌落数的选择n一个稀释度使用两个平板，计算平均数一个稀释度使用两个平板，计算平均数n其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数该稀释度的菌落数n若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘乘2以代表全皿菌落数以代表全皿菌落数n平皿内如有链状菌落生长时，一条链，可视平皿内如有链状菌落生长时，一条链，可视为一个菌落数为一个菌落数稀释度的选择稀释度的选
15、择n应选择平均菌落数在应选择平均菌落数在30300之间的稀释度之间的稀释度n若有两个稀释度的菌落数均在若有两个稀释度的菌落数均在30300之间，则视之间，则视两者之比来决定两者之比来决定n比值小于或等于比值小于或等于2，应报告其平均数，应报告其平均数n若大于若大于2则报告其中较小的数字则报告其中较小的数字n平均菌落数均大于平均菌落数均大于300，按稀释度最高者报告，按稀释度最高者报告n平均菌落数均小于平均菌落数均小于30，按稀释度最低者报告，按稀释度最低者报告n均无菌落生长，以均无菌落生长，以1乘以最低稀释倍数报告乘以最低稀释倍数报告n均不在均不在30300之间，则以最接近之间，则以最接近30
16、或或300的平均的平均菌落数报告菌落数报告菌落数的报告菌落数的报告n平均菌落数乘以稀释倍数报告平均菌落数乘以稀释倍数报告n 菌落数在菌落数在100以内时，按其实有数报告以内时，按其实有数报告n大于大于100时，采用二位有效数字，也可时，采用二位有效数字，也可用用10的指数来表示。的指数来表示。表面涂布计数法表面涂布计数法表面涂布计数法表面涂布计数法特点特点n加样量小加样量小n可使用不透明培养基对细菌计数可使用不透明培养基对细菌计数 n培养基成分不耐热培养基成分不耐热n营养成分营养成分n鉴定成分鉴定成分n抑菌成分抑菌成分n菌落需再进行证实试验菌落需再进行证实试验 n可避免因热琼脂对待检菌的损伤可避免因热琼脂对待检菌的损伤 表面涂布计数法表面涂布计数法注意事项注意事项n涂布要均匀涂布要均匀n加量不宜过多加量不宜过多MPN法法（最可能数法）（最可能数法）10-110-210-3查查MPN表表MPN法特点法特点n半定量法半定量法n样品中混有其它细菌，无法采用平板菌落计样品中混有其它细菌，无法采用平板菌落计数数 n特别适宜对菌数少的样品进行选择性计数特别适宜对菌数少的样品进行选择性计数 目前目前
