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1、第四讲蛋白质结构解析技术一第一页，共七十六页。一、蛋白质测序的研究历史一、蛋白质测序的研究历史19471947采用部分水解的方法试图测定蛋白质的氨采用部分水解的方法试图测定蛋白质的氨基酸序列基酸序列Consden等利用色谱技术成功测定了等利用色谱技术成功测定了短杆菌肽短杆菌肽S6的氨基酸序列的氨基酸序列Sanger首次测定了首次测定了牛胰岛素牛胰岛素牛胰岛素牛胰岛素的一级结构（由的一级结构（由51个氨基酸残基组成）个氨基酸残基组成）Spackman、Stein、Moore制造了制造了自动化的氨基酸分自动化的氨基酸分自动化的氨基酸分自动化的氨基酸分析仪析仪析仪析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新
2、的阶段，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段Edman推出第一台推出第一台全自动测序仪全自动测序仪全自动测序仪全自动测序仪195819581955195519401940年前年前年前年前19671967第二页，共七十六页。lN-末端氨基酸的测定方法末端氨基酸的测定方法（主要（主要5类）类）1、二硝基氟苯法（、二硝基氟苯法（DNFB法、法、Sanger法）法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）法）DNS-氨基酸呈荧光氨基酸呈荧光3、异硫氰酸苯酯法（、异硫氰酸苯酯法（PITC法）法）4、DABITC法（法（甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯），），形成的形
3、成的DABIH氨基酸呈桔黄色（有颜色）氨基酸呈桔黄色（有颜色）5、氨肽酶法、氨肽酶法N-末端测定的方法末端测定的方法奠定了序列测定方法发展基础奠定了序列测定方法发展基础第三页，共七十六页。牛胰岛素（牛胰岛素（51aa）的一级结构）的一级结构l Sanger首次首次(DNFB法法)测定了牛胰岛素的一级结构测定了牛胰岛素的一级结构 Sanger法（测定蛋白法（测定蛋白N末端的方法）末端的方法）第四页，共七十六页。二、序列测定方法二、序列测定方法化学方法化学方法（一）（一）N N端测序法端测序法应用最广的应用最广的N N端顺序测定法大多仍以端顺序测定法大多仍以EdmanEdman降解原理为基础设计。
4、降解原理为基础设计。利用化学试剂和控制反应条件，从利用化学试剂和控制反应条件，从N N端开始，将肽链逐步降解，进行氨基酸序列的测定端开始，将肽链逐步降解，进行氨基酸序列的测定的方法。的方法。 1 1、EdmanEdman降解法降解法异硫异硫氰氰酸苯酯（酸苯酯（PITCPITC）法）法特点：特点：可以测定氨基酸的排列顺序（包括可以测定氨基酸的排列顺序（包括N N端分析）。端分析）。适用于手工操作，也可设计自动化测定仪器适用于手工操作，也可设计自动化测定仪器（1 1）原理：）原理：四点：四点： 异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯(PITC)(PITC)偶联偶联 ATZ - ATZ -氨基酸裂解氨基酸裂解 P
5、TH- PTH-氨基酸转化氨基酸转化 PTH- PTH-氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定第五页，共七十六页。偶联：偶联：偶联：偶联：自由自由-氨基与异硫氰酸苯氨基与异硫氰酸苯酯酯(PITC)试剂偶联，与其紧挨试剂偶联，与其紧挨的第二个残基的键合力大大减的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。弱，很容易断裂。裂解：裂解：裂解：裂解：在无水条件下酸在无水条件下酸（F3CCOOH）裂解，形成）裂解，形成苯氨基噻唑啉酮衍生物（苯氨基噻唑啉酮衍生物（ATZ-氨基酸）和失去末端氨基酸残基氨基酸）和失去末端氨基酸残基的多肽，又可与的多肽，又可与PITC进行偶联进行偶联反应，下一轮降解。反应，下一轮降解。转化：转化
6、：转化：转化：ATZ-氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液（25%）可转化成稳定的）可转化成稳定的PTH-氨基酸。氨基酸。PTH-氨基酸的氨基酸的鉴定鉴定：可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相：可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。色谱及质谱等各种手段进行分析。乙内酰苯硫脲氨基酸乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH氨基酸氨基酸)。PITC试剂试剂ATZ-氨基酸氨基酸第六页，共七十六页。单单向向纸纸层层析析氨基酸鉴定氨基酸鉴定PTH-氨基酸氨基酸与标准氨基酸（与标准氨基酸（PITC试剂反应）对照试剂反应）对照第七页，共七十六页。双向纸层析双向纸层析第八页，共
7、七十六页。薄层层析（薄层层析（TLC）第九页，共七十六页。高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）（highperformanceliquidchromatography）第十页，共七十六页。（2）氨基酸序列分析仪器氨基酸序列分析仪器l以以Edman法测序，手工操作繁琐，工作量大法测序，手工操作繁琐，工作量大l根据根据Edman降解的原理降解的原理自动化分析仪器自动化分析仪器l自自70年代初全自动序列仪诞生以来，经过了一系列更新换代，年代初全自动序列仪诞生以来，经过了一系列更新换代，仪器日趋灵敏、快速。仪器日趋灵敏、快速。l灵敏度达灵敏度达0.1pmol蛋白蛋白3种代表性的测序仪器简单介绍如下：种
8、代表性的测序仪器简单介绍如下：第十一页，共七十六页。 液相旋转杯序列仪液相旋转杯序列仪l最初的自动化仪器，对自动化测序意义很大。最初的自动化仪器，对自动化测序意义很大。l测定程序：测定程序：整个仪器的整个仪器的“核心核心”部分是一个反应杯，它由一个马达带动并有调速控制。部分是一个反应杯，它由一个马达带动并有调速控制。蛋白质或多肽样品经导管注入反应杯，通过旋转离心力被均匀地涂在杯壁上，蛋白质或多肽样品经导管注入反应杯，通过旋转离心力被均匀地涂在杯壁上，形成一层薄膜，其厚薄可由转速控制。形成一层薄膜，其厚薄可由转速控制。反应试剂和溶剂分别通过导管进入反应杯，与杯内薄层上的样品的反应试剂和溶剂分别通
9、过导管进入反应杯，与杯内薄层上的样品的N端端自由氨基进行自由氨基进行Edman反应；反应；降解下来的降解下来的ATZ氨基酸衍生物通过另一导管引出并收集；氨基酸衍生物通过另一导管引出并收集；再将再将ATZ氨基酸氨基酸PTH氨基酸氨基酸鉴定；鉴定；洗涤反应杯，依次循环分析。洗涤反应杯，依次循环分析。l特点：该仪器样品流失较大，样品消耗量大，目前已很少使用。特点：该仪器样品流失较大，样品消耗量大，目前已很少使用。第十二页，共七十六页。固相序列分析仪固相序列分析仪发展的动力和原因：发展的动力和原因：克服液相旋转杯分析仪的缺点。克服液相旋转杯分析仪的缺点。多肽不易吸附旋转杯上，样品流失较大；多肽不易吸附
10、旋转杯上，样品流失较大；原理：原理：蛋白质蛋白质C端羧基共价固定在惰性载体上，进行端羧基共价固定在惰性载体上，进行Edman降解。降解。特点：特点：样品与载体共价结合，洗涤和抽提等过程不会丢失样品，增加循环次数。样品与载体共价结合，洗涤和抽提等过程不会丢失样品，增加循环次数。缺点：缺点：（1）若多肽中其它残基的羧基与载体结合，影响测定。）若多肽中其它残基的羧基与载体结合，影响测定。如：酸性氨基酸残基（如：酸性氨基酸残基（Asp、Glu）（2）测定效率低）测定效率低第十三页，共七十六页。3-氨基丙基玻璃氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基氨基乙基)-3-氨基丙基玻璃氨基丙基玻璃惰性载体惰性载体成功的关
11、键是肽段的固定，目前采用成功的关键是肽段的固定，目前采用C端端-羧基固定法，重复法高，高丝氨酸内羧基固定法，重复法高，高丝氨酸内酯法及双异硫氰酯法酯法及双异硫氰酯法(DITC)最好，固定率可达最好，固定率可达90-95%。 第十四页，共七十六页。气相蛋白序列分析仪气相蛋白序列分析仪弹筒型玻璃反应室弹筒型玻璃反应室反应室容积反应室容积0.05ml，代替液相序列仪中的旋转玻璃杯，代替液相序列仪中的旋转玻璃杯，用一种惰性聚合物用一种惰性聚合物“polybrene”固定样品。固定样品。多肽链与气态试剂反应，完成多肽链与气态试剂反应，完成Edamn降解。降解。优点：优点：灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需
12、灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需10100pmol；试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的110，降低了费用；降低了费用；缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。趋势：趋势：灵敏度不断提高灵敏度不断提高第十五页，共七十六页。气相蛋白序列分析仪气相蛋白序列分析仪第十六页，共七十六页。（3）Edman方法改进方法改进DABITC法：法：1976年，（华裔科学家）张瑞耀提出年，（华裔科学家）张瑞耀提出试剂：试剂：甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯替代了替代了异硫氰酸苯酯（异硫氰酸苯酯（PITC）DABITC：4-
13、N,N-对甲氨基偶氮苯对甲氨基偶氮苯-4-异硫氰酸酯异硫氰酸酯原理：原理：与与PITC相似，形成有色产物相似，形成有色产物DABIH氨基酸，呈桔黄色氨基酸，呈桔黄色也称为有色的也称为有色的Edman降解法，降解法，氨基酸鉴定无需染色，肉眼可分辨氨基酸鉴定无需染色，肉眼可分辨特点：特点：灵敏度很高，分析小肽段只要几个灵敏度很高，分析小肽段只要几个nanomole样品即可。样品即可。但但DABITC试剂与多肽试剂与多肽N端端aa耦合率低（耦合率低（20%-30%），测序干扰大！如何解决？），测序干扰大！如何解决？DABITCPITC两种方法耦合，更加灵敏可靠。两种方法耦合，更加灵敏可靠。适用于：液
14、相还是固相，手工还是自动方法，效果良好。适用于：液相还是固相，手工还是自动方法，效果良好。异硫氰酸酯进行异硫氰酸酯进行35S标记：使分析样品更向微量化方向发展。标记：使分析样品更向微量化方向发展。第十七页，共七十六页。二甲氨基萘磺酰氯法（二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）法）荧光剂荧光剂DNS-Cl，与肽链，与肽链N端氨基反应生成端氨基反应生成DNS-肽肽经酸水解，经酸水解，N-末端残基形成末端残基形成DNS-氨基酸，检测灵敏度提高氨基酸，检测灵敏度提高310倍。倍。乙酸乙酯抽提，层析鉴定，乙酸乙酯抽提，层析鉴定，DNS-氨基酸于氨基酸于360nm或或280nm处产生强烈荧光，处产生强烈荧光
15、，根据荧光点位置确定根据荧光点位置确定N端氨基酸。端氨基酸。6MHCl，110水解过夜水解过夜DNS-脯氨酸脯氨酸70%被破坏。被破坏。GlnGlu，AsnAspTrp及其及其DNS衍生物完全被破坏衍生物完全被破坏(可用巯基乙烷磺酸真空下水解可用巯基乙烷磺酸真空下水解)特点：特点：不能连续降解，适用于不能连续降解，适用于N末端分析末端分析（n-1）肽荧光？荧光？第十八页，共七十六页。DNSEdman测定法测定法两种方法的结合两种方法的结合DNS法，灵敏的高，但不能连续进行法，灵敏的高，但不能连续进行Edman降解法降解法N肽肽DNS-ClN末端氨基酸测定末端氨基酸测定Edman降解除去降解除去
16、N末端氨基酸末端氨基酸水层（水层（n-1）肽）肽乙酸乙酯层乙酸乙酯层（N末端氨基酸衍生物）末端氨基酸衍生物）DNS-ClN末端氨基酸测定末端氨基酸测定Edman降解除去降解除去N末端氨基酸末端氨基酸DNSEdman测定流程示意图测定流程示意图第十九页，共七十六页。思考？为何要创新很多方法？什么样的方法能延续下去？第二十页，共七十六页。（4）氨基酸自动序列仪的使用方法）氨基酸自动序列仪的使用方法依据依据Ednan原理，氨基酸自动测序仪，序列分析加快原理，氨基酸自动测序仪，序列分析加快测序仪发展方向：微量化、自动化测序仪发展方向：微量化、自动化加样量达到微量：加样量达到微量：10-910-12mol水平水平推出从进样到色谱分析一体化分析仪推出从进样到色谱分析一体化分析仪举例：举例：Shimadzu（日本岛津）（日本岛津）公司公司PPSQ-21A氨基酸自动测序仪氨基酸自动测序仪工作原理：工作原理：Ednan降解，产物乙内酰苯硫脲氨基酸（降解，产物乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），柱前衍生的液相色氨基酸），柱前衍生的液相色谱（谱（HPLC）分析。）分析。第二十一页，共七十六页。工作流程工作
