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1、高效液相色谱法高效液相色谱法1第一节第一节 高效液相色谱高效液相色谱的定义及基本参数的定义及基本参数2定义定义 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器，在色谱柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。 3基本参数基本参数 （一）保留值（一）保留值 保留值是用来
2、描述样品组分在色谱柱中保留值是用来描述样品组分在色谱柱中保留程度的参数保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。并作为色谱定性的指标。其表示方法有保留时间、保留体积、调整其表示方法有保留时间、保留体积、调整保留时间和调整保留体积。保留时间和调整保留体积。4保留时间和保留体积保留时间和保留体积 一般认为一般认为一般认为一般认为, ,当进样量很小当进样量很小当进样量很小当进样量很小时时时时, ,样品从柱中流出呈高斯曲样品从柱中流出呈高斯曲样品从柱中流出呈高斯曲样品从柱中流出呈高斯曲线分布。从进样开始到峰极线分布。从进样开始到峰极线分布。从进样开始到峰极线分布。从进样开始到峰极大值所需时间时间称为保留大
3、值所需时间时间称为保留大值所需时间时间称为保留大值所需时间时间称为保留时间时间时间时间, ,以以以以t tR R表示。由于流出时表示。由于流出时表示。由于流出时表示。由于流出时间与流动相流速成反比间与流动相流速成反比间与流动相流速成反比间与流动相流速成反比, ,因此因此因此因此又可用保留体积作为保留值又可用保留体积作为保留值又可用保留体积作为保留值又可用保留体积作为保留值参数参数参数参数, ,以以以以V VR R表示。表示。表示。表示。V VR R=t=tR RF FC C 式中式中式中式中, tR, tR为保留时间为保留时间为保留时间为保留时间(min), F(min), FC C为流动相流
4、速（为流动相流速（为流动相流速（为流动相流速（ml/min)ml/min)。 5 某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出所需流动相体积所需流动相体积所需流动相体积所需流动相体积, ,一般情况下常以一般情况下常以一般情况下常以一般情况下常以mlml为单位。细内为单位。细内为单位。细内为单位。细内径柱和毛细管柱径柱和毛细管柱径柱和毛细管柱径柱和毛细管柱, ,由于所需流动相流量很小由于所需流动相流量很小由于所需流动相流量很小由于所需流动相流量很小, F, FC C的的的的单位用单位用单位
5、用单位用1/min1/min表示表示表示表示, ,此时此时此时此时V VR R可采用为可采用为可采用为可采用为11单位。单位。单位。单位。 不保留物质流出时间以不保留物质流出时间以不保留物质流出时间以不保留物质流出时间以t tMM表示表示表示表示, ,又称死时间。又称死时间。又称死时间。又称死时间。而而而而t tMMF FC C即为保留物质死体积即为保留物质死体积即为保留物质死体积即为保留物质死体积, ,简称死体积简称死体积简称死体积简称死体积(V(VMM) )。死体积不仅与柱结构有关死体积不仅与柱结构有关死体积不仅与柱结构有关死体积不仅与柱结构有关, ,而且与进样系统、检测而且与进样系统、检
6、测而且与进样系统、检测而且与进样系统、检测系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, t, tMMF FC C才表示柱内流动相所占的体积。以才表示柱内流动相所占的体积。以才表示柱内流动相所占的体积。以才表示柱内流动相所占的体积。以V VMM表示。表示。表示。表示。任何色谱过程的基本保留方程式为任何色谱过程的基本保留方程式为任何色谱过程的基本保留方程式为任何色谱过程的基本保留方程式为V VR R=V=VMM+KV+KVS S式式式式中中中中,K,K为平衡分配系数为平衡分配系数为
7、平衡分配系数为平衡分配系数, V, VS S为固定相体积为固定相体积为固定相体积为固定相体积,Vm,Vm为柱内为柱内为柱内为柱内流动相所占体积流动相所占体积流动相所占体积流动相所占体积( (当柱外体积不容忽略时当柱外体积不容忽略时当柱外体积不容忽略时当柱外体积不容忽略时,Vm,Vm表示表示表示表示柱内空隙及柱外体积之总和柱内空隙及柱外体积之总和柱内空隙及柱外体积之总和柱内空隙及柱外体积之总和) )。6 溶质的色谱保留行为主要是由该溶质在溶质的色谱保留行为主要是由该溶质在固定相和流动相中的平衡分配系数固定相和流动相中的平衡分配系数K所决定所决定的的,而而K是溶质在两相间达到平衡分配时性质是溶质在
8、两相间达到平衡分配时性质上的度量。其定义为上的度量。其定义为,溶质在两相间达到平溶质在两相间达到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。衡时在固定相和流动相中的浓度比。 K= K= 溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度(m(ms s/V/Vs s) ) = = mms s V Vmm 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度(m(mmm/V/Vmm) m) mmm V Vs s 式中式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流动分别为溶质在固定相和流动相中的质量。相中的质量。7调整保留时间和调整保留体积调整保留时间和调整保
9、留体积 扣除死时间或死体积的保留值扣除死时间或死体积的保留值扣除死时间或死体积的保留值扣除死时间或死体积的保留值, ,定义为调整保定义为调整保定义为调整保定义为调整保留时间留时间留时间留时间(t (t R R) )和调整保留体积和调整保留体积和调整保留体积和调整保留体积(V(V R R), ),如下式所示。如下式所示。如下式所示。如下式所示。 t t R R =t =tR R-t -tMM V V R R =V =VR R-V-VMM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱
10、操作条件一定时操作条件一定时操作条件一定时操作条件一定时, ,不同物质的有其特定的保留值。不同物质的有其特定的保留值。不同物质的有其特定的保留值。不同物质的有其特定的保留值。这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中, ,由由由由于流动相参与了溶质分配过程于流动相参与了溶质分配过程于流动相参与了溶质分配过程于流动相参与了溶质分配过程, ,因此因此因此因此, ,样品组分的保样品组分的保样品组分的保样品组分的保留值不仅与固定相的性质有关留值不仅与固定相的性质有关留值不仅与固定相的性
11、质有关留值不仅与固定相的性质有关, ,而且受流动相性质而且受流动相性质而且受流动相性质而且受流动相性质变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成对保留值的影响对保留值的影响对保留值的影响对保留值的影响, ,是分离条件最佳化的基础。是分离条件最佳化的基础。是分离条件最佳化的基础。是分离条件最佳化的基础。8容量因子容量因子(k) 容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数容量因子是色谱法中广泛采
12、用的保留值参数, ,它是样品组分的质量在两相中分配的比值它是样品组分的质量在两相中分配的比值它是样品组分的质量在两相中分配的比值它是样品组分的质量在两相中分配的比值, ,定义为定义为定义为定义为 k k = =固定相中溶质的质量固定相中溶质的质量固定相中溶质的质量固定相中溶质的质量(m(ms s) ) = k = kV Vs s 流动相中溶质的质量流动相中溶质的质量流动相中溶质的质量流动相中溶质的质量(m(mmm) V) Vmm V VR R=V=Vmm+k+k (V(Vmm/V/Vs s) ) V Vs s= V= Vmm+k+k V Vmsms = V = Vmsms (1+k(1+k )
13、 ) 式两边除以冲洗剂流速式两边除以冲洗剂流速式两边除以冲洗剂流速式两边除以冲洗剂流速FcFc则得则得则得则得 t tR R = t = tMM(1+k(1+k ) ) k k = t= tR R/t/tMM-1= t-1= tR R /t/tMM 可见可见可见可见, ,容量因子就是调整保留时间与死时间的容量因子就是调整保留时间与死时间的容量因子就是调整保留时间与死时间的容量因子就是调整保留时间与死时间的比值。在液相色谱中，比值。在液相色谱中，比值。在液相色谱中，比值。在液相色谱中，k k 只与固定相、流动相性只与固定相、流动相性只与固定相、流动相性只与固定相、流动相性质及柱温有关质及柱温有关
14、质及柱温有关质及柱温有关, ,而与流速和柱尺寸无关。而与流速和柱尺寸无关。而与流速和柱尺寸无关。而与流速和柱尺寸无关。9理论塔板数理论塔板数n和塔板高度和塔板高度H 理论塔板数理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相是反映物质在固定相和流动相中动力学特性的重要色谱参数中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色它是代表色谱柱分离效能的指标。谱柱分离效能的指标。 计算公式为计算公式为: n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间为保留时间, W为峰宽，为峰宽， Wh/2为半高峰宽为半高峰宽 塔板高度塔板高度H计算公式为：计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。为色谱柱长度。1
15、0分离因子分离因子()及分离度（及分离度（R） 1.分离因子分离因子() = k2/k1=tR2/tR1 代表了二个物质在相同的色谱条件下的分代表了二个物质在相同的色谱条件下的分离选择性。物质的化学性质或结构上的差离选择性。物质的化学性质或结构上的差异异,反映在与固定相和流动相之间作用力也反映在与固定相和流动相之间作用力也有所差异上。这就是色谱分离的基础。有所差异上。这就是色谱分离的基础。11 改变改变是改变后一组分相对于前一组分的保是改变后一组分相对于前一组分的保留时间。留时间。的改变可以选择不同的固定相或的改变可以选择不同的固定相或流动相来实现。但改变固定相在液相色谱流动相来实现。但改变固
16、定相在液相色谱中比较麻烦。如在一个色谱系统中中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根用二根不同固定的柱子不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的则又必须考虑到流动相的适应性。比较行之有效的办法是改变流动适应性。比较行之有效的办法是改变流动相的极性相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯如采用连续改变流动相极性的梯度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择性。性。12 2.分离度（分离度（R） 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能的是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度杂质的分离度,也可以通过测定待测组分与也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分某一添加的指标性成分(内标物质或其他难内标物质或其他难分离物质分离物质)的分离度的分离度,或将供试品或对照品用或将供试品或对照品用适当的方法降解适当的方法降解,通过测定待测组分与某一通过测定待测组分与某一降解产物的分离度降解产物的分离度,对色谱系统进行评价与对色谱
