GJ -1000高压气体基因枪便 用 说 明 书宁波新芝生物科技股份地址:宁波家高新技术F=1区木槿路65号315013 ：0574.8713480787133995 ：0574-87113393网 址： E-mail:GJ-1000高压气体基因枪使用说明书•使用GJ-1000高压气体基因枪前须认真阅读本手册使用说明书！•操作者应遵守实验室高压气体使用制度！基因枪技术是将遗传物质直接导入细胞、组织和细胞器的一种全新的技术宁波新芝 科技研制的GJ-1000高压气体基因枪是间接发射DNA微弹的仪器做植物细胞时 选用氮气、氨气等压缩气体作为动力源都是可以的，但氮气的费用更为经济，而且发射微 弹的速度指标能到达要求但在神经细胞领域或细胞壁紧固的细胞应采用氢气一、仪器的结构和原理（见附录六图一）选用高纯度高压气体99.999% （氮气或氯气），使气体基因枪产生一种“冷”的气体冲 击波进入样品室，利用不同厚度的可破裂膜来调控气体压力（3.5 MPa、4.5MPa、6.5 MPa、 7MPa）,例如当需要用9MPa时可用两片4.5膜组合，当气体压力到达可破裂膜临界压力时, 可破裂膜爆破，通过特殊结构产生的气体冲击波随之驱动载体膜，并把涂在载体膜上的微粒子弹（DNA的外 源物质）利用惯性继续向下高速运动，直接轰击在样品室底部的靶细胞中。
整个系统采用抽双真空形式，封闭在一个圆筒真空室中，真空度可到达-0.095Mpa气 体最高输入压力为lOMpao二、仪器的安装1、基因枪必须放在生物用的超净台上工作2、基因枪与高压气体钢瓶间的连接（由本公司提供带压力表的压力管1套连接），整个 压力系统要求到达密封不漏气连接前可先用钢瓶小流量放气冲洗此管1-2秒此 时如听到有声音产生，说明压力系统漏气，或翻开气体开关，用肥皂水涂向连接头 处，观察其气泡现象，如气泡被吹走，说明漏气现象存在发现上述情况应再一次 拧紧气管接头螺母至不漏气为止3、基因枪与真空泵的真空管道之间的连接（由本公司提供专用的塑料真空管1根连接）, 整个真空系统耍求到达密封不漏气真空泵电源线插头插入基因枪反面的真空电源 输出位置4、基因枪电源线插头插入电压（220AC、50Hz）的单相接地三线插座中5、翻开气体钢瓶的阀门，接通基因枪电源，按下电源开关，指示灯亮，按下高压触发 按钮（尽可能的快），以确认气、电连接正常三、仪器的操作程序（-）实验前准备1、用75%酒精对枪室、样品圆筒室及气体加速管包括封口螺母进行消毒灭菌2、将可破裂膜在100%酒精中浸泡15分钟消毒，然后在无菌条件下干燥；飞行膜用78% 酒精消毒；钢膜那么在121c高温消毒20分钟后充分烘干（也可用75%酒精消毒）。
3、清洁高压管道，在新装基因枪或重新搬动位置时，连接高压气体钢瓶与压力调节阀、 表系统的高压管道的一端接口，另一端先不与基因枪的接口相连，握住此端朝向地 面，使钢瓶放气（小流量）冲洗此管1-2秒，再连接到基因枪上4、消毒操作工具5、准备包覆DNA6、真空泵的使用请阅读说明书二）操作步骤1 .先将升降手柄外拉、下压并向前推到卡住位置，取下样品室及载体膜座2 .选择所需压力强度的爆破膜，将它放在爆破膜螺母的内圆孔的台肩上，将爆破膜螺母 旋在储气仓螺口上，用球形扳手将螺母旋紧，确保不漏气3 .见附录六图二：把网膜座放入载体膜座内，依次放入网膜，网膜压圈a当做神经细胞类时，用钢膜结构，把钢膜垫放入网膜压圈内，在钢膜上涂抹DNA 微粒，（可在钢膜架上操作）微干后用镣子夹起（微粒朝下）倒放在钢膜垫上，，加 上钢膜压圈，旋紧载体膜封口螺帽b一般实验选用飞行膜结构，把飞行膜嵌入飞行膜座后涂DNA,待基本干燥后，连 同飞行膜座倒放在网膜压圈上（涂上DNA的一面朝下），拧紧载体膜封口螺帽，即 可一般一次用六个飞行膜座同时涂上DNA）4 .镜子将样品皿放入基因枪样品架上此样品架可在样品室内选择合适位置（阻挡板 下外表到样品平面之间的距离，范围从45至125之间设定）。
5 .将已涂上DNA微弹的载体膜座装在已装好样品的样品室上方，并一起安装在升降底 座上将升降手柄拉出后，样品室上升，使三件体结合在一起，件与件之间都有密 封圈密封6 .翻开真空泵开关，（注意：开前必须先加油至油位线，严禁无油运行，详见真空泵说 明书）按下真空开关，真空泵开始工作，真空表指示针指示真空下降，当真空度达 到-0.085〜-0.095Mpa时，（假设真空抽不上，可能三件体没合上，可微微移动一下三 件体），使样品室保持密封，到达所需要的真空度7 .按高压触发按钮向储气仓内充气，同时观察高压气体监测表的压力值在到达爆破 膜的压力时，瞬间产生一个气体冲击载体膜，同时载体膜外表上微弹（包覆DNA微 粒）通过网膜继续高速飞行射入靶细胞中做动物细胞时真空度可选-0.05Mpa左 右）8 .关闭真空开关，按下真空释放按钮，使系统卸荷并将样品取出这样一次基因导入 试验完毕9 .按操作步骤1取出样品室与载体膜座，从样品室的样品皿座上取出样品皿，盖上盖 子，编号、记录试验内容及条件10、从载体膜座圆孔穴中取出载体膜，接着拧下封口螺母，从圆孔台肩上取出已穿孔的 爆破膜11、从步骤3开始重复操作，完成所有样品处理。
12、关机：基因枪用完后应关闭气瓶阀门，按下高压触发按钮使高压管内存余气体释放 关闭电源总开关，从插座上拔下电源线插头13、试验完毕后进行整理、清洁工作一般采用75%的酒精清洗样品室上下密封圈请 用真空脂涂上保存★试验前样品室要用75%酒精擦干，以防污染★钢瓶的保养和平安操作应严格按照钢瓶使用说明书★使用氮气时系统中严格禁油四、装箱清单(1)主机(包括样品皿座)(2)主机电源线1台 (11)载体膜:1根(3)真空泵连电源线1台(4)真空密封脂1盒(5)专用扳手(17X19) (14X17)2 把(6)专用扳手(球型)1把(7)活动扳手250X201把(8)保险丝5A2个(9)真空管(塑管)1根(10)压力调节阀、表(带高压管)1套(11)爆破膜(100个)3包a飞行膜(100片)1包(12)网膜(50个)(13)飞行膜座(14 )0型密封圈站(15)说明书(16)合格证(17)保修卡(18)钢膜架(19)鸨粉1包6个X130 4 只1份1份1份1个1瓶备注：鸨粉仅供试枪用，实际实验不提倡采用附录一DNA子弹的制备（）※空气湿度＜20%,操作时用培养皿装上CaCb（干燥剂），加滤纸，上放飞行膜 架，涂子弹时可防止吸潮结块。
第一步：金粉或鸨粉的清洗根据需要称量例如：（1） 60mg（金粉或鸨粉）放在离心管中加新的100%无水酒精，用超声波粉碎机 分散至手感温度略发烫2）离心，弃掉上清液3）力口 1ml无水酒精，漩涡振荡3-5分钟4）静止1分钟5）离心，弃掉上清液6）加入1ml消毒蒸播水，漩涡振荡，离心沉淀，弃掉上清液（重复3次）7）在沉淀的金粉或鸨粉中加入50%甘油，浓度为60mg （金粉或鸨粉）/ml 第二步：DNA子弹的制作（1）振荡在50%甘油中的金粉或铝粉，使之成为悬浮液2）取50ul悬浮液于离心管中（此管可打6枪，根据实验样品多少预先分几 个小管）3）取一个小管边振荡边在液体上的壁处用加样器加入5-10ul质粒DNA （浓 度为lug/ul），振荡30秒，再边振荡边在小管壁上加入50ul氯化钙溶液 （2.5M）,振荡30秒，边振荡边加入20ul亚精胺（0.1M）,漩涡振荡30秒 -1分钟，然后冰上静置1分钟，8000转/分钟离心1分钟，弃掉上清液4）加入150U170%酒精,吹打一下沉淀，假设沉淀均匀散开,那么离心（速度3000rpm 时间10秒），去掉上清液，加入无水酒精，进入第（5）步操作，假设吹打不 散，那么用超声波超声，条件为：加70%的酒精至600ul,功率200W,超声时 间1秒，4-6次，然后再离心，弃上清液。
5）加入150 ul 100%无水酒精，不破坏沉淀，静置1分钟，弃上清液6）加入60 ul无水酒精振荡使成悬浮液，如悬浮分散良好，可将此悬浮液用 加样器取样10 ul分别滴在载体膜上（载体膜使用前用无水酒精洗涤），共可加样 在6片载体膜上这样平均每片载体膜为：0.5 mg金粉或鸨粉,0.8 ug DNA（以 5 ul质粒DNA计，质粒多一些效果会好一点）附录二影响基因枪转化的因素影响基因枪系统转化效率的因素很多，众多研究者对此进行了系统的研究, 提高基因枪转化效率的关键因素是使可能多的完整的DNA分子进入更多的受 体细胞内，另一方面是使细胞受到的伤害减少到最低限度现摘录一些观点以 供研究者参考1、理化因素理化因素是指基因枪的一些轰击参数，包括可破裂膜的压力，阻挡板到靶 细胞的距离(射程)，样品室内的真空度，轰击次数，DNA的浓度与纯度，DNA 沉淀剂(氯化钙与亚精胺)的浓度等根据转化受体材料的特点，这些参数都 可做相应调整1)可破裂膜的压力不同将影响微弹对组织和细胞的穿透力不同的材料对 压力要求不尽相同因此，应根据具体材料做相应的改变2)射程也是一个重要因素，如植物组织中只有某些特定的细胞具有再生能 力，因此，可通过调节射程优先转化这些细胞。
在动力来源固定的情况 下，射程越大，穿透力越小，射程越小，对细胞造成的损伤越大，因此 不同的材料必需选择合适的距离3)为了减少空气对微弹的阻力，样品室内要求一定的真空度，真空度与转 化比例成正相关，但靶细胞具有一定耐受性在使用GJ-1000高压气体 基因枪时，植物细胞以0.095Mpa为宜4)实验证明轰击次数太多也会造成对细胞的伤害，因此一般以2-3次为宜5)DNA纯度越高，转化效果越好但转化率并不与DNA的浓度成正比， 相反,DNA的终浓度过高会与微弹形成大的凝结，反而降低了转化频率, 目前普遍采用DNA浓度为lug/uloDNA沉淀对转化率影响颇大如去除氯化钙会使转化率大大降低，氯化 钙最适浓度在2.5M之间，亚精氨的最适浓度为0.1M之间6) 100%的乙醇，每次必须新开瓶，因为很容易吸水，造成子弹结块，不能 表达，同时子弹制备中、制备后都应防潮，采取干燥存放2、生理因素轰击前后的培养条件对转化率有较大影响，另外处于不同生理状态的材料 接受外源DNA的能力是不同的，一般认为生理活性高的组织或细胞有利于DAN 的摄入和整合如高渗和脱水处理可以提高转化率同时基因枪导入基因的技术是一种复杂的综合技术、经验科学，需要使用者不断地通过实践积累经验、优化条件。
附录三常见问题原因及可能排除的方法DNA制备时子弹结块不分散DNA浓度太高、不纯或结构太大，100%酒精不纯,操作时吸水氤金氨不新鲜 离心速度太高，最后一次离心速度可降至3000rpm 10-20 秒超声波处理200W、2-3次、每次工作1秒真空抽不上真空抽不上高压气体漏气察其气样品被击飞圆筒样品室加速管及底座三体没合上真空泵连接不紧气体钢瓶管道连接不紧，可用肥皂水洒向连接头处观泡情况，应用扳手拧紧；使用氮气时严格禁油气体压力太大，调换可破裂膜调整射击距离可破裂膜未爆破气瓶气体压力不够可破裂膜未装妥，重新安装检查膜的厚度及数量高压触发按钮时间可保持至1秒左右附录使用GJ-1000型高压气体基因枪，实验条件参考表受体名称真空度压力气。