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1、第五讲基因芯片检测技术演示文稿第一页，共七十四页。基因芯片检测技术第二页，共七十四页。简介当荧光染料被激发光激发后，便会产生荧光光子，荧当荧光染料被激发光激发后，便会产生荧光光子，荧光的强弱代表了荧光化合物的含量，因此可以用光探光的强弱代表了荧光化合物的含量，因此可以用光探测器对产生的荧光进行定量检测，以确定荧光化合物测器对产生的荧光进行定量检测，以确定荧光化合物的含量，从而计算出的含量，从而计算出DNADNA或或RNARNA的含量。的含量。生物芯片的扫描是指将与目标生物芯片的扫描是指将与目标DNADNA（或（或RNARNA）杂交后、）杂交后、或与目标抗原、抗体、或受体等目标靶分子反应结或与目
2、标抗原、抗体、或受体等目标靶分子反应结合后的生物芯片上成千上万个点阵的生物反应结果合后的生物芯片上成千上万个点阵的生物反应结果阅读出来，转变成为可供计算机处理的数据。阅读出来，转变成为可供计算机处理的数据。第三页，共七十四页。简介根据生物芯片所使用的标记物不同，相应的信号检测根据生物芯片所使用的标记物不同，相应的信号检测方法有放射性同位素法、生物素标记法、荧光染料标方法有放射性同位素法、生物素标记法、荧光染料标记法等。记法等。目前基因芯片最普遍采用的标记和检测法是荧光法，目前基因芯片最普遍采用的标记和检测法是荧光法，相应的检测装置主要有激光共聚焦显微镜、相应的检测装置主要有激光共聚焦显微镜、C
3、CDCCD相机、相机、激光扫描荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等。激光扫描荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等。基因芯片检测系统可以分为硬件系统和软件系统两个部分，基因芯片检测系统可以分为硬件系统和软件系统两个部分，由于常用的基因芯片检测系统采用扫描的方式得到图像，由于常用的基因芯片检测系统采用扫描的方式得到图像，因此又称为基因芯片扫描仪。因此又称为基因芯片扫描仪。第四页，共七十四页。扫描仪第五页，共七十四页。基因芯片检测仪芯片检测体系的硬件部分主要包括：照明光源、光路系统、光探测器、机械部分和A/D转换器等。第六页，共七十四页。照明光源当荧光化合物或者染料受到特定波长的激发光激发后，会吸收激发光子，然
4、后发射荧光光子。选择光源（荧光染料激发光的光源）遵循两个原则：一是为了提高检测的灵敏度，需要选择高强度的激发光源，以激发较多的荧光光子，二是激发光的波长范围要避免将其所激发的荧光波长覆盖。第七页，共七十四页。荧光染料与荧光光谱各种荧光化合物有各自特定的最大激发光吸收波长和最各种荧光化合物有各自特定的最大激发光吸收波长和最大发射波长。两峰值波长差值称为斯托克斯位移大发射波长。两峰值波长差值称为斯托克斯位移(Stokes shift)(Stokes shift)。斯托克斯位移太小，激发光和发射荧光。斯托克斯位移太小，激发光和发射荧光的光谱有较大部分重叠，影响对荧光强度的测量精度。的光谱有较大部分重
5、叠，影响对荧光强度的测量精度。实际中，选取斯托克斯位移较大的荧光材料。实际中，选取斯托克斯位移较大的荧光材料。Cy3 550-570nm 20nm Cy5 649-670nm 21nmCy3 550-570nm 20nm Cy5 649-670nm 21nm荧光强度在一定范围内与激发光的强度成正比。荧光强度在一定范围内与激发光的强度成正比。荧光分子受到激发后，以球状方式发射荧光光子荧光分子受到激发后，以球状方式发射荧光光子第八页，共七十四页。激光光源单色性好、方向性好、能量集中、亮度高、相干性好、单色性好、方向性好、能量集中、亮度高、相干性好、能产生强度较高的发射荧光，可以大大地提高检测灵能产
6、生强度较高的发射荧光，可以大大地提高检测灵敏度敏度为了同时检测多种荧光，在具体实现过程中，光源为了同时检测多种荧光，在具体实现过程中，光源系统都设计成多波长结构，通常采用多个激光器。系统都设计成多波长结构，通常采用多个激光器。气体激光器，比如氦氖激光器，输出连续光，输出光气体激光器，比如氦氖激光器，输出连续光，输出光束质量很好，单色性好，稳定性高，输出光为可见光。束质量很好，单色性好，稳定性高，输出光为可见光。半导体激光器，波长范围广。体积小，质量轻，价半导体激光器，波长范围广。体积小，质量轻，价格便宜。格便宜。第九页，共七十四页。非激光光源非激光光源，波长范围比较宽。为了避免激发光对荧光的干
7、扰，通常需要加装滤光片来选择与荧光最大激发波长相吻合的光。要检测多种荧光，采用多个滤光片来选择多种特定的波长低氩汞灯和短弧氙灯。第十页，共七十四页。照明方式照明区域是线和面，可以同时激发大面积的荧光，实现光强的均匀性，主要是非激光光源。激光高相干性，在较大面积上光强很难一致。一般激光光源为点照明方式，为了实现大面积成像，必须通过扫描来实现。第十一页，共七十四页。第十二页，共七十四页。第十三页，共七十四页。第十四页，共七十四页。光路系统光收集：荧光收集多采用光学透镜系统，透镜收集光收集：荧光收集多采用光学透镜系统，透镜收集光的立体角的大小直接影响系统的效率光的立体角的大小直接影响系统的效率 。透
8、镜收。透镜收集光的效率以数码孔径（集光的效率以数码孔径（NANA）表示。）表示。NANA为为1.01.0，表，表明透镜收集了整个半球面的光，相对应的光收集效明透镜收集了整个半球面的光，相对应的光收集效率为率为5050。多数共聚焦激光微阵列扫描仪物镜的。多数共聚焦激光微阵列扫描仪物镜的NANA为为0.50.50.90.9，而绝大多数，而绝大多数CCDCCD阵列扫描仪的阵列扫描仪的NANA为为0.20.20.50.5。 激发激发/ /发射光的识别和分离：由于荧光发射强度要远远发射光的识别和分离：由于荧光发射强度要远远小于激发光强度，因此要从激发光中检测出微弱的荧光小于激发光强度，因此要从激发光中检
9、测出微弱的荧光信号，就需要对这两种类型的光进行分离。信号，就需要对这两种类型的光进行分离。 第十五页，共七十四页。激发/发射光的识别和分离 几何分离：根据激发光和荧光光路的几何关系进行分离。几何分离：根据激发光和荧光光路的几何关系进行分离。一种方式用一个很小的反光镜将激发光束反射，而让环形一种方式用一个很小的反光镜将激发光束反射，而让环形部分的荧光光束通过；另一种方式是激发光束和系统光路部分的荧光光束通过；另一种方式是激发光束和系统光路不同轴，在成像过程中，激发光束所成的像和荧光光束所不同轴，在成像过程中，激发光束所成的像和荧光光束所成的像会发生分离，从而过滤掉激发光束。但由于光学系成的像会发
10、生分离，从而过滤掉激发光束。但由于光学系统各种表面的反射和散射，会使部分激发光混入检测系统统各种表面的反射和散射，会使部分激发光混入检测系统中，通常的解决办法是在探测器前放滤光片对荧光进行过中，通常的解决办法是在探测器前放滤光片对荧光进行过滤。滤。波长分离：根据激发光和荧光的波长差异进行分离。波长分离：根据激发光和荧光的波长差异进行分离。根据激发光波长和荧光波长不完全重合的事实，用滤根据激发光波长和荧光波长不完全重合的事实，用滤光片将其分离。光片将其分离。 第十六页，共七十四页。激发光的入射角度芯片不平整，芯片表面的灰尘，片基不均匀，环境中的尘芯片不平整，芯片表面的灰尘，片基不均匀，环境中的尘
11、粒都会引起光的强烈散射，产生散射光，另外入射光照在粒都会引起光的强烈散射，产生散射光，另外入射光照在芯片上也产生反射光。但干涉滤光片不能完全滤除散射光芯片上也产生反射光。但干涉滤光片不能完全滤除散射光与反射光。与反射光。检测角度确定时，杂质微粒引起的散射光的强度与入射光角度检测角度确定时，杂质微粒引起的散射光的强度与入射光角度有关。入射光与检测角成有关。入射光与检测角成0 0度时最强，度时最强，9090度时最弱。度时最弱。但生物芯片扫描仪难以实现与入射光成但生物芯片扫描仪难以实现与入射光成9090度的检测，因为荧度的检测，因为荧光检测必须在芯片的正上方，与芯片垂直，以保证最大的采光检测必须在芯
12、片的正上方，与芯片垂直，以保证最大的采光量并避免芯片荧光图像的失真。光量并避免芯片荧光图像的失真。入射光与检测成入射光与检测成0 0度是激光系统芯片扫描仪常采用的方式。度是激光系统芯片扫描仪常采用的方式。CCDCCD系统芯片扫描仪及部分激光系统扫描仪多采用入射光与系统芯片扫描仪及部分激光系统扫描仪多采用入射光与检测成检测成4545度或度或135135度的方式。度的方式。第十七页，共七十四页。光漂白现象 光漂白是指荧光染料分子在激发光的照射下，其产生荧光漂白是指荧光染料分子在激发光的照射下，其产生荧光的强度随着时间的延长逐渐变弱消失的过程。光的强度随着时间的延长逐渐变弱消失的过程。几乎所有的荧光
13、染料都存在这种光漂白现象几乎所有的荧光染料都存在这种光漂白现象, , 光漂光漂白的程度随光照强度的增加和照射时间的延长而增白的程度随光照强度的增加和照射时间的延长而增强。强。激光系统扫描仪中，聚焦后的激光束直径较小，一般在激光系统扫描仪中，聚焦后的激光束直径较小，一般在5 510m10m，光强较大，因此光漂白的作用较强。，光强较大，因此光漂白的作用较强。CCDCCD系统虽系统虽然激发光较弱，但然激发光较弱，但CCDCCD扫描时通常采用长时间曝光方式，扫描时通常采用长时间曝光方式，因此也同样存在光漂白现象。因此也同样存在光漂白现象。 第十八页，共七十四页。在生物芯片扫描中，通常一次扫描产生的光漂
14、白并不在生物芯片扫描中，通常一次扫描产生的光漂白并不显著，可以忽略，但是多次重复扫描产生的光漂白必显著，可以忽略，但是多次重复扫描产生的光漂白必须考虑。须考虑。Cy3Cy3多次扫描测定，平均每扫描一次，荧光强度下降多次扫描测定，平均每扫描一次，荧光强度下降0.7%0.7%。可见光漂的作用还是比较强的。可见光漂的作用还是比较强的。第十九页，共七十四页。光探测器光探测器是基因芯片扫描仪检测系统的核心器件，其主要用途是探测荧光光子，并把荧光光子的光信号转变成模拟的电信号。目前基因芯片扫描仪所选用的光探测器件各不相同，主要有基于用PMT（photomultiplier tube，光电倍增管）和CCD（
15、charge-coupled devices，电荷偶合器件）作为感光器件的两种 第二十页，共七十四页。光电倍增管（PMT）第二十一页，共七十四页。光电倍增管（PMT）增益依赖于光电倍增管内部光阴极的数量和加在光电倍增管上的电压，光阴极的数量多、电压高则增益大。芯片扫描仪用光电倍增管的选择应考虑下列两个因素。一是由于不同的光阴极模式对不同的波长的光的灵敏度不一样，因此应选择对被测荧光波长灵敏度高的光电倍增管；而是应选择耐用的高信噪比的光电倍增管。第二十二页，共七十四页。PMT的优点和缺点PMTPMT的优点的优点 ：光电倍增管在可见光波范围内是最灵：光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器，通过
16、改变电压可以很方便地改变光电敏的探测器，通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度；一般用激光作为激发光源，能激倍增管的灵敏度；一般用激光作为激发光源，能激发出较强的荧光，增加灵敏度发出较强的荧光，增加灵敏度 ；通过点成像探测；通过点成像探测并结合高速并结合高速XYXY轴扫描而实现对生物芯片进行扫读，轴扫描而实现对生物芯片进行扫读，均一性好均一性好 ；可以与共聚焦系统相兼容以降低背景；可以与共聚焦系统相兼容以降低背景噪声噪声 。 PMT PMT的缺点的缺点 ：由于采用点成像探测及：由于采用点成像探测及XYXY轴扫描，成像轴扫描，成像速度较慢，一般需要速度较慢，一般需要1010分钟以上分钟以上 ；虽然激光光源使用；虽然激光光源使用寿命可以达到几千小时以上，但光源随着使用时间的延寿命可以达到几千小时以上，但光源随着使用时间的延长而老化，其强度逐渐减弱，导致灵敏度随着使用时间长而老化，其强度逐渐减弱，导致灵敏度随着使用时间的延长而降低。的延长而降低。 第二十三页，共七十四页。CCD的优点和缺点CCDCCD的优点的优点 ：CCDCCD一次可成像很大面积的区域，激发光一次可成像很大面积的区域
