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1、生化制药基本技术演示文稿第一页，共八十三页。第一页，共八十三页。优选生化制药基本技术第二页，共八十三页。第二页，共八十三页。生物材料、发酵或培养液生物材料、发酵或培养液预处理（清洗、加热、调预处理（清洗、加热、调pH、凝聚、絮凝）、凝聚、絮凝）细胞分离（沉降、离心、过滤）细胞分离（沉降、离心、过滤）细胞细胞细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）收集上清液收集上清液初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤）初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤）高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等）高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等）
2、成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等）成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等）图图2-1 生化药物提取的一般工艺流程生化药物提取的一般工艺流程上清液（含胞外产品）上清液（含胞外产品）第三页，共八十三页。第三页，共八十三页。一、原料的选取与保存原料的选取与保存 选择原则：选择原则：有效成分含量高，原料新鲜；有效成分含量高，原料新鲜； 原料来源丰富，易得，原料成本低；原料来源丰富，易得，原料成本低； 原料中杂质含量较少等。原料中杂质含量较少等。植物材料确定后，要选择合适的季节、地点、时间后采集并就地去除植物材料确定后，要选择合适的季节、地点、时间后采集并就
3、地去除不用的部分，将有用的部分保鲜处理。不用的部分，将有用的部分保鲜处理。保存生物材料的方法主要方法有冷冻法，常用保存生物材料的方法主要方法有冷冻法，常用-40速冻；有机溶剂脱速冻；有机溶剂脱水法；防腐剂保鲜法。水法；防腐剂保鲜法。第四页，共八十三页。第四页，共八十三页。二、生化药物提取二、生化药物提取1. 物理性质与提取物理性质与提取提取提取是利用目的物的溶解特性，将其与细胞的固形成分或其它结合成分分是利用目的物的溶解特性，将其与细胞的固形成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状态转入特定溶液环境的过程。离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状态转入特定溶液环境的过程。许
4、多生化药物具有生物活性，其稳定性受许多生化药物具有生物活性，其稳定性受pH、温度、离子强度、金属离子、提、温度、离子强度、金属离子、提取过程中所使用的溶剂等环境因素的影响。取过程中所使用的溶剂等环境因素的影响。 第五页，共八十三页。第五页，共八十三页。2. 提取的溶剂系统提取的溶剂系统（1）对水溶性、盐溶性生物物质的提取）对水溶性、盐溶性生物物质的提取 可用酸、碱、盐水溶液为提取剂。可用酸、碱、盐水溶液为提取剂。（2）对水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取）对水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取 可用表面活性剂或有机溶剂提取，用有机溶剂作为提取试剂时，根据产物可用表面活性剂或有机溶剂提取，用有
5、机溶剂作为提取试剂时，根据产物存在的状态可分为液存在的状态可分为液-液提取和固液提取和固-液提取。液提取。第六页，共八十三页。第六页，共八十三页。液液-液提取也即萃取，也是利用溶质在互不相溶的两相中分配系数液提取也即萃取，也是利用溶质在互不相溶的两相中分配系数不同而进行的提取分离的方法。不同而进行的提取分离的方法。杂质杂质溶质溶质原溶液原溶液萃取剂萃取剂Light phaseHeavy phase萃取相萃取相原溶液原溶液tC第七页，共八十三页。第七页，共八十三页。在一定温度和压力下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中达到平衡后，在一定温度和压力下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中达到平衡后，溶质在这
6、两相的浓度比为一常数溶质在这两相的浓度比为一常数K，此常数称为，此常数称为分配系数分配系数。在常温下为常数；的单位通常用在常温下为常数；的单位通常用mol/L或质量单位或质量单位/mL。第八页，共八十三页。第八页，共八十三页。工业生产中常用的萃取溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁工业生产中常用的萃取溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。酯等。表表2 青霉素在不同萃取剂中的分配系数青霉素在不同萃取剂中的分配系数 溶溶 剂剂 pH2.5pH2.5（溶剂（溶剂/ /水）水） pH7.0pH7.0（溶剂（溶剂/ /水）水）乙酸戊酯乙酸戊酯 45/1 1/23545/1 1/235乙酸丁酯
7、乙酸丁酯 47/1 1/18647/1 1/186乙酸乙酯乙酸乙酯 39/1 1/26039/1 1/260氯仿氯仿 39/1 1/22039/1 1/220三氯乙烯三氯乙烯 21/1 1/26021/1 1/260乙醚乙醚 12/1 1/19012/1 1/190第九页，共八十三页。第九页，共八十三页。物理化学方面物理化学方面有足有足够的容量的容量与水溶液不互溶，不与水溶液不互溶，不发生乳化生乳化对产物有高的分配系数物有高的分配系数低黏度低黏度在密度上同水有大的差在密度上同水有大的差别生物学方面生物学方面在消毒在消毒过程中程中热稳定定经济和毒理方面和毒理方面对生物催化生物催化剂、酶或活或活细
8、胞无毒性胞无毒性低成本低成本能大批供能大批供应对人人员无毒无毒不易燃不易燃表表1 1 在生物转化中萃取溶剂的选择准则在生物转化中萃取溶剂的选择准则第十页，共八十三页。第十页，共八十三页。固固-液提取也称为浸取。为了高效、快速地从固体中将目的物浸取出液提取也称为浸取。为了高效、快速地从固体中将目的物浸取出来，同时尽可能将杂质留在固体中，选择合适的溶剂很重要，溶剂选择来，同时尽可能将杂质留在固体中，选择合适的溶剂很重要，溶剂选择的主要依据是的主要依据是“相似相溶相似相溶”原理。原理。浸取常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂和乙浸取常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂和乙醚、
9、氯仿、苯等非极性溶剂。醚、氯仿、苯等非极性溶剂。无论采用哪种溶剂系统对目的物进行提取，在提取过程中都要尽量增加目无论采用哪种溶剂系统对目的物进行提取，在提取过程中都要尽量增加目的物的溶出度，并尽可能减少杂质的溶出度，同时充分重视目的物在提取的物的溶出度，并尽可能减少杂质的溶出度，同时充分重视目的物在提取过程中的活性变化。过程中的活性变化。第十一页，共八十三页。第十一页，共八十三页。三、细胞破碎技术三、细胞破碎技术植植物物细细胞胞模模式式图图第十二页，共八十三页。第十二页，共八十三页。1. 机械法：包括球磨法、高压匀浆法、超声破碎法、机械法：包括球磨法、高压匀浆法、超声破碎法、X-press等。
10、等。JJ-2组织捣碎匀浆机 第十三页，共八十三页。第十三页，共八十三页。 珠磨法珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法珠磨是常用的方法u*细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于小于1mm）一起快速搅拌或研）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。碎，释放出内含物。u在工业规模的破碎中，常采用高速珠在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机磨机WSKWSK卧式高效全能珠磨机卧式高效全能珠磨机第十四页，共八十三页。第十四页，
11、共八十三页。超声波破碎仪 第十五页，共八十三页。第十五页，共八十三页。技技术原理原理效果效果成本成本破碎率破碎率举例例高高压匀匀浆法法(孔型孔型)须使使细胞通胞通过小孔，小孔，使使细胞受到剪切力胞受到剪切力而破碎而破碎剧烈烈适中适中50%细胞胞悬浮液浮液大大规模模处理理珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或胞被玻璃珠或铁珠剪切碰撞珠剪切碰撞剧烈烈便宜便宜90%细胞胞悬浮液浮液和植物和植物细胞胞的大的大规模模处理理超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使用使细胞破碎胞破碎适中适中昂昂贵50%细胞胞悬浮液浮液小小规模模处理理*不同机械破碎方法的比较不同机械破碎方法的比较第十六页，共八十三页
12、。第十六页，共八十三页。2. 非机械法：酶溶法、化学渗透法、反复冻融法、干燥法等非机械法：酶溶法、化学渗透法、反复冻融法、干燥法等 酶酶溶溶法法的的缺缺点点在在于于酶酶的的价价格格昂昂贵贵限限制制了了在在大大规规模模生生产产中中的的使使用用，虽虽然然条条件件温温和和、具具有有选选择择性性。细细胞胞悬悬浮浮液液中中加加入入酶酶能能迅迅速速和和细细胞胞壁壁反反应应并并破破坏坏它它们们。酶酶选选择择性性的的催催化化细细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。第十七页，共八十三页。第十七页，共八十三页。第十八页，共八十三页。第十八页，共八十三页。四、固液分离四、固液分离固液
13、分离的方法很多，有重力沉降、离心分离和过滤等。固液分离的方法很多，有重力沉降、离心分离和过滤等。 离心：离心：借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分离的技术。同密度的粒子分离的技术。过滤：过滤：在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。粒子，进行固液分离的方法称为过滤。第十九页，共八十三页。第十九页，共八十三页。第二十页，共八十三页。第二十页，共八十三页。第二十一页，共八十三页。第二十一页，共八十三页。第二节第二节
14、沉淀技术沉淀技术沉淀：沉淀：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。的现象。根据沉淀机理不同，可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。根据沉淀机理不同，可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。第二十二页，共八十三页。第二十二页，共八十三页。一、盐析法一、盐析法 水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内（水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内（0.150.2mol/L）最大，低于或高于此范围时溶解度均降低。蛋白质在高）最大，低于或高于此范围时溶解度均降低。蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉
15、淀的现象称为盐析。不同蛋白离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象称为盐析。不同蛋白质盐析时所需的盐的浓度不同，因此调节盐的浓度，可以使混合蛋白质盐析时所需的盐的浓度不同，因此调节盐的浓度，可以使混合蛋白质溶液中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。质溶液中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。 常用的盐析用盐包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸常用的盐析用盐包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等。二氢钠等。第二十三页，共八十三页。第二十三页，共八十三页。第二十四页，共八十三页。第二十四页，共八十三页。二、有机溶剂沉淀法二、有机溶剂沉淀法 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂、
16、降低溶质的溶解向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂、降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法称为有机溶剂沉淀法。度，使其沉淀析出的分离纯化方法称为有机溶剂沉淀法。 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质用于低盐浓度下沉淀蛋白质。第二十五页，共八十三页。第二十五页，共八十三页。三、等电点沉淀法三、等电点沉淀法 两性电解质在溶液两性电解质在溶液pH处于等电点时，分子表面电荷为零，导处于等电点时，分子表面电荷为零，导致赖以稳定的电荷层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶致赖以稳定的电荷层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。解度降低。 调节溶液调节溶液pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作称为等值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作称为等电点沉淀法。电点沉淀法。第二十六页，共八十三页。第二十六页，共八十三页。第三第三节 色色谱技技术色谱：色谱：也称层析，是根据混合物中溶质在互不相溶的两相之间分也称层析，是根据混合物中溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起迁移速度不同而进
