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1、第2章核酸检测技术核酸检测技术直接对动植物有害生物基因序列和结构进行测定。核酸的分离纯化PCR技术核酸杂交技术第1节核酸的分离纯化核酸的分离纯化的原则1.保持核酸一级结构的完整性2.提高核酸制品的纯度技术路线的设计技术路线的设计破碎细胞的方法破碎细胞的方法机械机械 （匀浆、超声破、研磨等）（匀浆、超声破、研磨等）非机械非机械（化学处理、生化法）（化学处理、生化法）沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。优点优点缺点缺点乙醇乙醇对盐类沉淀少，对盐类沉淀少，易挥发除去，不易挥发除去，不影响后续实验影响后续实验需要量大，低温操需要量大，低温操作作异丙醇异丙醇需体积小，速度
2、需体积小，速度快，一般不需低快，一般不需低温长时间放置温长时间放置易使盐类、糖类与易使盐类、糖类与DNA共沉淀；异丙共沉淀；异丙醇难以挥发除去醇难以挥发除去核酸浓度检测与完整性测定方法核酸浓度检测与完整性测定方法浓度浓度测定测定 紫外分光光度法紫外分光光度法 260nm 荧光光度法荧光光度法 EB荧光完整性测定完整性测定琼脂糖凝胶电泳法：以琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。酸凝胶电泳结果为依据。基因组基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状片段如发生降解，电泳图呈拖尾状；完整的或降解很少的总完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧电泳图谱中，三条带
3、的荧光强度积分应呈特定的比值光强度积分应呈特定的比值问题一：问题一：DNA样品不纯样品不纯 抑制后续酶解和抑制后续酶解和PCR反应反应DNA提取常见问题提取常见问题DNA提取常见问题提取常见问题问题问题二二： DNA降解降解DNA提取常见问题提取常见问题问题问题三三： DNA提取量少提取量少真菌真菌昆虫昆虫第2节PCR扩增技术PCR, a DNA photocopierPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代
4、基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明Kary B. Mullis（1944）http:/1989年美国年美国Science杂志列杂志列PCR 为十余项重大为十余项重大科学
5、发明之首科学发明之首,比喻比喻1989年年为为PCR爆炸年爆炸年,Mullis荣获荣获1993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。1. PCR的基础PolymeraseChainReactionPCRThe only enzyme used in this reaction is DNA polymerase.PolymeraseChainReactionThe products of the first reaction become substrates of the following one, and so on.PCRPolymeraseChainReactionPCRCompone
6、nts：Thermostable DNA Polymerase， Target DNA，Pair of Primers， dNTPs， Mg+ ions， Buffer solution Denaturation：The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95Primer annealing: The temperature is reduced to around 55 to allow the primers to anneal.Polymerization (elongation, exten
7、sion): The temperature is increased to 72 for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg2+.The PCR cycle:Three different steps in each PCR cyclePCR的扩增？的扩增？ How does PCR workThe first cycleThe second cycle How does PCR workThe third cycleThe fourth cycle2. PCR的类型1.多重PCR（multiplex
8、 PCR）2.巢式PCR（nested PCR）3.定量PCR（quantitative PCR）4.不对称PCR（asymmetric PCR）5.反向PCR（inverse PCR）6.逆转录PCR（reverse transcription PCR）7.Overlap PCR PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLYTypically generates a product band for each primer pair多重PCR（multiplex PCR）:What2.1 多重PCR（multiplex PCR）Multiplex
9、 PCR: WhyDetect several genes at onceeg. transgenic plant screenInternal controlsVERY importantTells you how well the PCR reaction workedReduces “false negatives”Reduces “false positives”多重PCR（multiplex PCR）Multiplex PCR: HowSame as regular PCRCare in primer designMuch greater chance of primer-dimer
10、sMuch greater chance of artifactsAnnealing temperatures must be close多重PCR（multiplex PCR）A Typical Multiplex PCR ReactionSterile Water 34.0 ul10X PCR Buffer 5.0 ulMgCl2 (50mM) 2.5 uldNTPs (10mM each) 1.0 ul Primer1FWD 1.0 ul Primer1REV 1.0 ul Primer2FWD 1.0 ul Primer2REV 1.0 ul Primer3FWD 1.0 ul Pri
11、mer3REV 1.0 ulDNA Polymerase 0.5 ulDNA Template 1.0 ulTotal Volume 50.0 ul多重PCR（multiplex PCR）Multiplex PCR: ExampleThree primer pairsControl, resistance, and trait genesControl gene fragment is largest and (almost) faintestTrait gene is smallest and brightestResistance GeneTrait GeneControl GenePri
12、mers多重PCR（multiplex PCR）Multiplex PCR: ExampleThree primer pairsResistance GeneTrait GeneWhich are transgenic?Control GenePrimers多重PCR（multiplex PCR）Nested Multiplex PCR2nd Stage PCRDilute 100 foldBetween 1st & 2nd stage reactions1F1R2R3R5R6R3F2F6F4F5F4RPrimary Multiplex RT-PCR 多重PCR（multiplex PCR）2
13、.2 定量PCR（quantitative PCR）实时荧光定量实时荧光定量PCR （Real time Quantitative PCR）：）：在在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始进程，对起始模板进行定量分析的方法。模板进行定量分析的方法。Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle
14、(in real time) as opposed to the endpoint detection荧光定量荧光定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。与常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测（1）定量原理）定量原理三个概念：三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过CtCt值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进
15、行定量分析荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理 扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：基线期、：基线期、指数增长期指数增长期和和平台期平台期。Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）基线期基线期平台期平台期平台期平台期荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理荧光域值荧光域值Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）基线期基线期指数扩指数扩增期增期平台期平台期荧光域值荧光
16、域值手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段荧光定量荧光定量PCRPCR原理原理CtCt值值PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t) value 纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性Ct值的重现性值的重现性定量原理定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率扩增效率扩增效率 E（amplification efficiency）一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该直线斜率）即可计算出E值。在扩增产物达到阈值线时在扩增
