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1、 定量定量PCR技术的产生技术的产生n n1992年由HiguchiHiguchi等人第一次报告：使用等人第一次报告：使用EBEB内插染料法内插染料法插至双链插至双链DNADNA，经改装的带有冷经改装的带有冷CCDCCD的的PCRPCR仪检测样品的荧光强度n nPCRPCR循环循环 = = 双链双链DNA = DNA = 染料染料 = = 荧光荧光n n后来用与双链后来用与双链DNADNA有更强结合力的有更强结合力的SYBR Green ISYBR Green I取代取代EBEB第一页，共四十页。 荧光定量实时荧光定量实时PCR与普通与普通PCR的比较的比较n n实时在线监控实时在线监控实时在
2、线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期n n降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCRPCR反应的特异性反应的特异性n n增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量n n结果分析更加快捷方便，无需跑胶结果分析更加快捷方便，无需跑胶结果分析更加快捷方便，无需跑胶结果分析更加快捷方便，无需跑胶第二页，共四十页。 罗氏产品介绍以及与同类产品之间的对比第三页，共四十页。一、一、LC1.5和
3、和LC2.0LightCycler荧光定量荧光定量PCR系统系统 LC1.5LC2.0第四页，共四十页。Lightcycler 1.5 结构分析结构分析以空气加热及冷却迅速改变温度带有极高表面积/容量比例的密封20l毛细管加热线圈可容纳32个样品的卡盘将荧光仪定位的分档器发动机将样品置于光学仪上的分档器发动机热室风扇滤器免维护的LED光源光学倍增管第五页，共四十页。Lightcycler 2.0 结构分析结构分析空气加热系统空气加热系统LED激发光源激发光源PMT检检测测系系统统光纤光纤第六页，共四十页。热力学结构热力学结构特点： 1 1、空气加热、空气加热 2 2、毛细管反应体系、毛细管反应
4、体系优点优点: : 1 1、升降温速度快（、升降温速度快（0.05 -20/0.05 -20/秒），秒）， 2 2、体系均一，不存在边缘现象、体系均一，不存在边缘现象 3 3、把反应体系缩小到、把反应体系缩小到0-20ul0-20ul，节省试剂成本，节省试剂成本 实现快速实现快速PCRPCR第七页，共四十页。光学结构特点：特点：1、免维护的LED冷光源，寿命长达2万小时以上2 2、光学倍增管（、光学倍增管（RodenstockRodenstock ）3 3、多达、多达6 6通道（通道（LC2.0LC2.0）和）和3 3通道（通道（LC1.5LC1.5）实时检）实时检 测测优点：优点：1 1、毛
5、细管光学特性将光线散射、衍射降至最低，、毛细管光学特性将光线散射、衍射降至最低， 避免避免LED LED 功率低的问题功率低的问题2、免维护，带自动检验功能3 3、轻易实现内标、内对照及多重、轻易实现内标、内对照及多重PCRPCR第八页，共四十页。LightCycler 结构分析结构分析激发光源激发光源激发光源激发光源 Rodenstock-Rodenstock-LEDLED（发光二极（发光二极（发光二极（发光二极管）管）管）管） 冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。 检测系统检
6、测系统检测系统检测系统光学倍增管光学倍增管光学倍增管光学倍增管 (PMT)(PMT)灵敏度高，宽检验范围灵敏度高，宽检验范围灵敏度高，宽检验范围灵敏度高，宽检验范围, ,背景低，无边缘效应背景低，无边缘效应背景低，无边缘效应背景低，无边缘效应 加热方式加热方式加热方式加热方式空气加热空气加热空气加热空气加热管间差小，热传导速率管间差小，热传导速率管间差小，热传导速率管间差小，热传导速率2020/ /秒，温控变化准确秒，温控变化准确秒，温控变化准确秒，温控变化准确（0.05-200.05-20/ /秒）。秒）。秒）。秒）。 反应体系反应体系反应体系反应体系 两种石英玻璃毛两种石英玻璃毛两种石英玻
7、璃毛两种石英玻璃毛细管体系细管体系细管体系细管体系 (20ul (20ul 和和和和100ul)100ul) 光学性好，反应体系小，节约试剂成本光学性好，反应体系小，节约试剂成本光学性好，反应体系小，节约试剂成本光学性好，反应体系小，节约试剂成本, , , ,适合多适合多适合多适合多种用途。种用途。种用途。种用途。检测光路范围检测光路范围检测光路范围检测光路范围 530nm, 530nm, 555nm, 555nm, 610nm, 610nm, 640nm, 640nm, 670nm, 710nm.670nm, 710nm.六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题六个波长，并解决相关荧光素荧光干
8、扰问题六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题第九页，共四十页。 LightCycler 软件软件 4.0l l 更先进的自动定量方法l l全新的相对定量软件l l全自动熔点曲线分组l l全自动熔点温度提示l l简化数据和用户管理第十页，共四十页。PCRPCR领域最聪明的革新领域最聪明的革新 LightCyclerLightCycler荧光定量荧光定量PCRPCR系统l l超高速超高速 3 30 0至至4040分钟完成分钟完成PCRPCR过程过程l l实时在线监测实时在线监测 收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上l
9、 l高灵敏高灵敏 在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝l l范围广范围广 可检测可检测1 10 010101010拷贝线性范围，无需稀释样品拷贝线性范围，无需稀释样品l l开放性开放性 全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台l l六个荧光通道六个荧光通道 轻易实现内标、内对照或多重轻易实现内标、内对照或多重PCRPCRl l最小化最小化 定量反应体积降至定量反应体积降至10102020ulul，费用低廉费用低廉l l灵活性灵活性 支持水解探针、杂交探针及支持水解探针、杂交探针及 SYBR Green ISYBR Gr
10、een Il l闭管分析闭管分析 消除污染风险消除污染风险第十一页，共四十页。Lightcycler 的分析模式适用于所有的通用探针及染料分析模式：适用于所有的通用探针及染料分析模式：适用于所有的通用探针及染料分析模式：适用于所有的通用探针及染料分析模式：n n SYBR Green I SYBR Green I（荧光染料）（荧光染料）n nTaqMan（水解探针）n nMolecular beaconMolecular beacon（分子信标）（分子信标）n nLightcyclerLightcycler上开发独有的分析模式：上开发独有的分析模式：上开发独有的分析模式：上开发独有的分析模式：
11、n nHybridization Probe FormatHybridization Probe Format（杂交探针）（杂交探针）n nSimpleProbe SimpleProbe （单探针）（单探针）第十二页，共四十页。 SYBR-Green I 检测模式检测模式 SYBR Green SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，在外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中， SYBR Green I I可与新合成地双链可与新合成地双链DNADNA结合，产生地荧光信号结合，产生地荧光信号强度与双链强度与双链DNADNA含量成正比，荧光检测在每一循环的延含量成正比，荧光检测在每一
12、循环的延期后进行。期后进行。 SYBR Green SYBR Green I与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过融解曲线分析而得到解决。第十三页，共四十页。 水解探针（水解探针（Taqman ）检测模式）检测模式 同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条探针同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸收，因而检测不到荧光。在收，因而检测不到荧光。在PCRPCR延伸时，因延伸时，因TaqTaq酶具有的酶具有的5 5，3 3，核酸外切酶活性，可降解荧光探针，使荧光发光分子与核
13、酸外切酶活性，可降解荧光探针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光源激发下即可发出荧光，荧光荧光淬灭分子分开，在外界光源激发下即可发出荧光，荧光强度与强度与PCRPCR扩增产物量有关。扩增产物量有关。第十四页，共四十页。 分子信标（分子信标（Molecular Beacon Probe） 独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成，探针的5端标记荧光分子，3端 标记一个吸收或淬灭荧光的分子 。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5端荧光分子与3端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增
14、强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。第十五页，共四十页。 杂交探针（HybProbe）检测模式 设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对寡核设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对寡核苷酸（既杂交探针），在与扩增的苷酸（既杂交探针），在与扩增的DNADNA片断杂交时，两种片断杂交时，两种染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光源激发后，将染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光源激发后，将能量传递给附近的受体染料，既发生荧光共振能量转移能量传递给附近的受体染料，既发生荧光共振能量转移（FRETFRET），从而释放出受体染料分子的发射波长荧光信号。），从而释放出受体染料分
15、子的发射波长荧光信号。荧光信号的强度和荧光信号的强度和DNADNA的产量成正比。其他非特异性产物的产量成正比。其他非特异性产物由于不会与探针杂交，因而不产生信号干扰。由于不会与探针杂交，因而不产生信号干扰。第十六页，共四十页。 AnnealingElongationEnd of ElongationDenaturationFluoresceinLC Redfor sequence specific detection of DNA杂交探针检测罗氏专利性技术杂交探针检测罗氏专利性技术第十七页，共四十页。Template: Plasmid; Target: CycA; Detection Form
16、at: Hybridization ProbesStandard Calculated concentration9.522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E+29.276E+11.085E+1H2O1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2O杂交探针的优点：杂交探针的优点：1.灵敏度高灵敏度高2.宽动力学范围宽动力学范围3.特异性高特异性高4.可用于突变分析可用于突变分析Monitoring of PCR with the LightCyclerUsing Hybridization Probes第十八页，共四十页。 专用于SNP基因分型和突变检测的 SimpleProbe SimpleProbe SimpleProbe作为一种独特的杂交探针只含有一条寡核苷酸作为一种独特的杂交探针只含有一条寡核苷酸探针，能够特异性的与目的基因上含有探针，能够特异性的与目的基因上含有SNPSNP位点的靶序列结合位点的靶序列结合。探针与靶序列
