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1、代谢组学技术及其在代谢组学技术及其在中药研究中的应用中药研究中的应用 代谢组学代谢组学 概概 念念n是生物体或细胞在外源性物质或病理生理刺激和遗是生物体或细胞在外源性物质或病理生理刺激和遗传因素改变的条件下，传因素改变的条件下，内源性代谢物内源性代谢物会发生变化，会发生变化，利用现代分析方法对体液、细胞或组织中的利用现代分析方法对体液、细胞或组织中的所有所有低低分子量分子量内源性代谢物组内源性代谢物组（endogenousmetabolitesendogenousmetabolites）进行定性、定量分析，定量检测其代谢变化，通过进行定性、定量分析，定量检测其代谢变化，通过测定整个机体的系统测
2、定整个机体的系统代谢图谱代谢图谱来探讨基因功能调控来探讨基因功能调控机制的学科机制的学科 Wuhan university吸收吸收分布分布代谢代谢排泄排泄内源性代谢物改变内源性代谢物改变药物药物外源性代谢产物外源性代谢产物内源性代谢产物是基因表达的终产物，代谢组学所内源性代谢产物是基因表达的终产物，代谢组学所关注的是相对分子质量为关注的是相对分子质量为1,0001,000以下的小分子物质以下的小分子物质Wuhan university病理生理的变化病理生理的变化历史沿革历史沿革n英国帝国理工大学英国帝国理工大学J.K NicholsonJ.K Nicholson教授的研究小组教授的研究小组利用
3、核磁共振利用核磁共振( (NMRNMR) )技术分析大鼠的尿液技术分析大鼠的尿液, , 并于并于19991999年年J.K NicholsonJ.K Nicholson教授等教授等3 3名科研人员共同发名科研人员共同发表了一篇表了一篇“代谢组学代谢组学”研究论文，一个新的学科研究论文，一个新的学科从此诞生，从此诞生，NicholsonNicholson教授也由于其在代谢组学发教授也由于其在代谢组学发展中的开拓性的贡献，而被誉为展中的开拓性的贡献，而被誉为“国际代谢组学国际代谢组学之父之父”Wuhan university历史沿革历史沿革 n是继基因组学、转录物组学、蛋白质组学之后的一门新型学科
4、，是系统是继基因组学、转录物组学、蛋白质组学之后的一门新型学科，是系统生物学的重要组成部分生物学的重要组成部分n系统生物学（系统生物学（system biologysystem biology）研究的四个层次：）研究的四个层次： Wuhan university系系统统生生物物学学 基因与蛋白质的表达紧密相连基因与蛋白质的表达紧密相连, ,代谢代谢物则更多地反映了细胞所处的环境。正物则更多地反映了细胞所处的环境。正如如Billy DavidBilly David所言所言: :“基因组学和蛋白基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么质组学告诉你可能发生什么, ,而代谢组学而代谢组学则告诉你已经发生
5、了什么则告诉你已经发生了什么” 历史沿革历史沿革Wuhan university历史沿革历史沿革 n19991999年年NicholsonNicholson首次提出了以首次提出了以NMRNMR分析为主的代谢组学研究模分析为主的代谢组学研究模式并联合国际六大医药公司式并联合国际六大医药公司（Bristol-Meyers-Bristol-Meyers-Squibb,EliSquibb,Eli lilly,Hoffmann-laRoche,NovoNordisklilly,Hoffmann-laRoche,NovoNordisk, , Pfizer,PharmaciaPfizer,Pharmacia
6、）英国帝国学院（）英国帝国学院（Imperial Imperial College,LondonCollege,London）面对风险的挑战，于）面对风险的挑战，于20012001年组织并公布了一年组织并公布了一个研究计划个研究计划COMETCOMET（Consortium for Consortium for MetabonomicMetabonomic ToxicologyToxicology）, ,应用代谢物组学评价药物毒性，进行候选药物应用代谢物组学评价药物毒性，进行候选药物的临床前毒性筛选，进而对广泛模型化合物评价和安全性预测，的临床前毒性筛选，进而对广泛模型化合物评价和安全性预测，
7、以缩短药物开发的时间，减少损失以缩短药物开发的时间，减少损失.3.3年中对大鼠和小鼠的尿液年中对大鼠和小鼠的尿液用用NMRNMR分析研究了分析研究了150150个肝肾毒性模型个肝肾毒性模型 Wuhan university历史沿革历史沿革n自自20022002年第一届国际植物代谢组学大会在荷兰瓦赫宁根召年第一届国际植物代谢组学大会在荷兰瓦赫宁根召开以来，植物代谢组学分析技术和方法发展迅速已开始应开以来，植物代谢组学分析技术和方法发展迅速已开始应用于植物科学研究、生物安全性评价等多个领域，在基因用于植物科学研究、生物安全性评价等多个领域，在基因功能研究、代谢途径及代谢网络调控机理的解析等方面发功
8、能研究、代谢途径及代谢网络调控机理的解析等方面发挥重要作用挥重要作用n我国植物代谢组学的研究于我国植物代谢组学的研究于20052005年前后开始起步，目前已年前后开始起步，目前已形成较好的发展趋势形成较好的发展趋势Wuhan university代谢组学研究的优势代谢组学研究的优势 与研究蛋白组或基因组相比，研究代谢组具有许多优势：与研究蛋白组或基因组相比，研究代谢组具有许多优势：(1)(1)生物体的小分子代谢产物所构成的代谢组要比转录物组生物体的小分子代谢产物所构成的代谢组要比转录物组蛋白组简单得多蛋白组简单得多( (例如酿酒酵母有例如酿酒酵母有6 0006 000多个基因，但代谢物多个基因
9、，但代谢物仅有仅有600600个个) )，那么分析代谢组就降低了样本的复杂性；，那么分析代谢组就降低了样本的复杂性；(2)(2)对多数小分子内源性代谢产物的作用及其所在代谢通路对多数小分子内源性代谢产物的作用及其所在代谢通路代谢调控已有相当的认识，而目前对基因功能与调控的认识代谢调控已有相当的认识，而目前对基因功能与调控的认识仍相当有限仍相当有限Wuhan university代谢组学研究的优势代谢组学研究的优势(3)(3)代谢组是基因功能活动的终点。代谢控制理论和实验证代谢组是基因功能活动的终点。代谢控制理论和实验证明在一个生化反应中，虽然酶的浓度和代谢通量不会发生明在一个生化反应中，虽然酶
10、的浓度和代谢通量不会发生重大变化，但是代谢物的浓度会发生很大变化，因此针对重大变化，但是代谢物的浓度会发生很大变化，因此针对代谢变化重大的代谢物进行分析更加直观，也更加敏感代谢变化重大的代谢物进行分析更加直观，也更加敏感代谢组是基因表达的下游产物，所以它更能正确地反映细代谢组是基因表达的下游产物，所以它更能正确地反映细胞的功能水平，与蛋白组或基因组相比，代谢组具有终点胞的功能水平，与蛋白组或基因组相比，代谢组具有终点放大的特征。研究表明代谢通量不仅受基因表达控制，而放大的特征。研究表明代谢通量不仅受基因表达控制，而且还受环境的调节，因此，测量下游产物代谢物较为合适且还受环境的调节，因此，测量下
11、游产物代谢物较为合适从这一角度分析，代谢组包含的信息量要大于基因组、蛋从这一角度分析，代谢组包含的信息量要大于基因组、蛋白组学白组学Wuhan university代谢组学研究的优势代谢组学研究的优势(4)(4)代谢组变化揭示的是系列关联代谢组变化揭示的是系列关联生物标记物生物标记物(biomarker)(biomarker)的综合差异，要比传统依赖单一标志物的诊断方法具有更的综合差异，要比传统依赖单一标志物的诊断方法具有更高的准确性，而且其最小限度的侵入性以及时空动态性，高的准确性，而且其最小限度的侵入性以及时空动态性，是基因组和蛋白组学研究所无法比拟的。是基因组和蛋白组学研究所无法比拟的。
12、(5)(5)代谢物谱在不同生物样本中基本上都是一样的，再加代谢物谱在不同生物样本中基本上都是一样的，再加上其检测技术的多样性，代谢组学的研究具有较好的便利上其检测技术的多样性，代谢组学的研究具有较好的便利性性Wuhan university代谢组学研究的特点代谢组学研究的特点代谢组学作为一门新兴学科，概括起来具有以下特点代谢组学作为一门新兴学科，概括起来具有以下特点: :对机体损伤小，其检测的体液主要是尿液与血液；对机体损伤小，其检测的体液主要是尿液与血液；信息量大，代谢组学能够提供整个机体功能统一性信息；信息量大，代谢组学能够提供整个机体功能统一性信息；检测更容易，基因和蛋白质表达的有效的微
13、量变化会在代检测更容易，基因和蛋白质表达的有效的微量变化会在代谢物上得到放大；谢物上得到放大；无需特征化的数据库；无需特征化的数据库；检测物种类少，代谢物的种类数远远小于基因和蛋白数目检测物种类少，代谢物的种类数远远小于基因和蛋白数目代谢物产物具有通用性；代谢物产物具有通用性；能够反映生理病理状态能够反映生理病理状态Wuhan university研究方法研究方法 代谢组学研究步骤包括：代谢组学研究步骤包括：样品采集与制备；样品采集与制备；样品分析与鉴定；样品分析与鉴定；数据处理与分析；数据处理与分析；生物标志物（生物标志物（MarkersMarkers）分析）分析 Wuhan univers
14、ityWuhan university研究方法研究方法样品采集与制备：样品采集与制备： 采集后的样品需首先进行预处理，而且整个预处理过程应尽采集后的样品需首先进行预处理，而且整个预处理过程应尽可能保留和体现样品中完整的代谢物组分信息。可能保留和体现样品中完整的代谢物组分信息。 组织样品取样后，由于酶活性和氧化过程的继续，会引起代组织样品取样后，由于酶活性和氧化过程的继续，会引起代谢物的生成和改变，故样品需即时用谢物的生成和改变，故样品需即时用液氮冷冻，低温（液氮冷冻，低温（- -8080）贮存）贮存。血和尿样也应在。血和尿样也应在-80-80保存，尿样中还要加叠保存，尿样中还要加叠氮化钠抑菌氮
15、化钠抑菌Wuhan university研究方法研究方法 尿样或稀释的尿样可直接进样，优点是在样品制备时，代尿样或稀释的尿样可直接进样，优点是在样品制备时，代谢物没有损伤，高通量。缺点是直接用谢物没有损伤，高通量。缺点是直接用ESI/MSESI/MS分析时，盐分析时，盐类有抑制作用（代谢物之间也会相互抑制），在类有抑制作用（代谢物之间也会相互抑制），在ESIESI过程中过程中生成加合物，不挥发物的积累会降低仪器性能。生成加合物，不挥发物的积累会降低仪器性能。血液和尿样常用甲醇、乙腈或混合溶剂沉淀蛋白，离心后血液和尿样常用甲醇、乙腈或混合溶剂沉淀蛋白，离心后取上清液进行分析或除去溶剂后，用取上清
16、液进行分析或除去溶剂后，用LCLC流动相溶解后分析流动相溶解后分析溶剂萃取应用得最早，冷冻的组织样品常用溶剂萃取，样溶剂萃取应用得最早，冷冻的组织样品常用溶剂萃取，样品需要在冷冻情况下粉碎，选用极性与非极性溶剂的结合品需要在冷冻情况下粉碎，选用极性与非极性溶剂的结合如甲醇如甲醇/ /氯仿，可形成双相，分别对水溶性及脂溶性相进行氯仿，可形成双相，分别对水溶性及脂溶性相进行分析分析Wuhan university研究方法研究方法 样品分析与鉴定：样品分析与鉴定： 近年来，各种分离分析手段如色谱、质谱、核磁共振近年来，各种分离分析手段如色谱、质谱、核磁共振（NMRNMR）、毛细管电泳、红外光谱等及其联用技术都应用于）、毛细管电泳、红外光谱等及其联用技术都应用于代谢组学的研究中，其中最常用的分析技术是代谢组学的研究中，其中最常用的分析技术是NMRNMR技术和技术和GC-GC-MSMS、LC-MSLC-MS等各种联用技术。等各种联用技术。NMRNMR方法具有无损伤性，无偏向方法具有无损伤性，无偏向性等特点，但其灵敏度较低；性等特点，但其灵敏度较低；GC-MSGC-MS方法具有较高的分辨率方法具有
