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1、第四章 目的基因的转化及其原理第一节第一节植物基因工程载体及其构建植物基因工程载体及其构建1PPT课件植物基因转化系统植物基因转化系统载体转化系统（载体转化系统（Ti质粒转化载体质粒转化载体，Ri质粒转化载质粒转化载体）体）原生质体原生质体DNA直接导入转化系统直接导入转化系统基因枪基因枪DNA导入转化系统导入转化系统花粉粒介导转化系统花粉粒介导转化系统2PPT课件一、植物基因工程载体命名规则及种类一、植物基因工程载体命名规则及种类1、植物基因工程载体命名规则：、植物基因工程载体命名规则：(1) pSC101plasmidStanleyCohen(人名)pTiT37/pAtT37根癌农杆菌的质
2、粒类型根癌农杆菌的质粒类型（Agrobacterium tumefaciens）pRiT37/pArT37发根农杆菌的质粒类型发根农杆菌的质粒类型（Agrobacterium rhizogenes）3PPT课件（2）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，如：如：leu （亮氨酸基因位点）（亮氨酸基因位点）基因表现型用正体表示，如基因表现型用正体表示，如Leu（3）基因中任何位点发生突变则在该基因符号后）基因中任何位点发生突变则在该基因符号后加该位点斜体大写字母，如亮氨酸加该位点斜体大写字母，如亮氨酸A、B位点分别位点分别为突变型或缺陷型，表示为：为突变型
3、或缺陷型，表示为：leuA、leuB(4)抗性和敏感性分别用抗性和敏感性分别用R或或r，S或或s表示表示 4PPT课件2 2、植物基因工程载体的种类及特性、植物基因工程载体的种类及特性植物基因工植物基因工程载体程载体克隆载体克隆载体中间载体中间载体中间克隆载体中间克隆载体中间表达载体中间表达载体卸甲载体卸甲载体onc-onc+转化载体转化载体中间黏粒载体中间黏粒载体质粒质粒/黏粒载体黏粒载体基因标记载体基因标记载体一元转化载体一元转化载体（顺式载体）（顺式载体）双元转化载体双元转化载体（反式式载体）（反式式载体）共整合载体共整合载体SEV（拼接末端载体；（拼接末端载体；split-endvec
4、tor）5PPT课件二、根二、根癌农杆菌癌农杆菌TiTi质粒的结构与功能质粒的结构与功能 1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能质粒的遗传特性、结构及功能2、T-DNA的基因结构与功能的基因结构与功能3、Vir区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能 6PPT课件一、一、TiTi质粒的遗传特性、结构及质粒的遗传特性、结构及功能功能1.Ti质粒的遗传特性及类型质粒的遗传特性及类型Ti质质粒粒是是根根癌癌农农杆杆菌菌染染色色体体外外的的遗遗传传物物质质，为为双双股股共共价价闭闭合合的环状的环状DNA分子。分子。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿
5、碱种类不同，Ti质粒质粒可以被分成四种类型：可以被分成四种类型：章鱼碱型章鱼碱型(octopine)胭脂碱型胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型）或称琥珀碱型(succinamopine)7PPT课件图图3-1章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒基因图。质粒基因图。章鱼碱基因章鱼碱基因T-DNA区区结合转移区结合转移区冠瘿碱代谢冠瘿碱代谢复制起始区复制起始区毒力区毒力区生长素基因生长素基因细胞分裂素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成冠瘿碱合成8PPT课件2.Ti质粒的功能质粒的功能区域区域Ti质粒可分为四个区：质粒可
6、分为四个区：（1）T-DNA区（区（transferred-DNAregions）：）： T-DNA是是农农杆杆菌菌侵侵染染植植物物细细胞胞时时，从从Ti质质粒粒上上切切割割下下来来转转移移到到植植物物细细胞胞的的一一段段DNA，称称为为转转移移DNA。该该DNA片片段上的基因与肿瘤的形成有关。段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（区（virulenceregion）该该区区段段上上的的基基因因能能激激活活T-DNA转转移移，使使农农杆杆菌菌表表现现出出毒毒性性，故故称称之之为为毒毒区区。T-DNA区区与与Vir区区在在质质粒粒DNA上上彼彼此此相相邻邻，约占约占Ti质粒质粒DNA的三分
7、之一。的三分之一。9PPT课件（3）Con区（区（regionsencodingconjugations）该该区区段段上上存存在在着着与与细细菌菌间间接接合合转转移移的的有有关关基基因因（tra），调调控控Ti质质粒粒在在农农杆杆菌菌之之间间的的转转移移。冠冠瘿瘿碱碱能能激激活活tra基基因因，诱诱导导Ti质质粒粒转转移，因此称之为接合转移编码区。移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（区（originofreplication）该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。质粒的自我复制，故称之为复制起始区。10PPT课件3.Ti质粒的生物学功能质粒的生物学功能T
8、iTi质粒的功能可归为以下质粒的功能可归为以下质粒的功能可归为以下质粒的功能可归为以下7 7个方面个方面个方面个方面: :参与参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动）和一些细胞分裂素的活动。诱发诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。赋予赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。赋予赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。为为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力农杆菌提供附
9、着于植物细胞壁的能力。决定决定寄主菌株的植物寄主范围寄主菌株的植物寄主范围。有有的的Ti质质粒粒能能够够抑抑制制某某些些根根瘤瘤土土壤壤杆杆菌菌噬噬菌菌体体生生长长与与发发育育，即即具具有有对对噬噬菌菌体的体的“排外性排外性”。11PPT课件表表4-1Ti质粒放入部分基因及其功能质粒放入部分基因及其功能基因缩写基因缩写表型及功能表型及功能在基因图上的位置（在基因图上的位置（kb）pTiC58（211kb）pTiAch5（195kb）age排斥噬菌体排斥噬菌体API111-11310-12agr对对PAT-K84质粒编码的农杆菌素敏感质粒编码的农杆菌素敏感138-141arc分解精氨酸分解精氨酸
10、4-59-10agc分解农杆菌分解农杆菌54-57noc分解胭脂碱分解胭脂碱18-20nos合成胭脂碱合成胭脂碱0-1occ分解章鱼碱分解章鱼碱39-41ocs合成章鱼碱合成章鱼碱0-1ori复制起点复制起点33-3590-95roi（tmr）抑制长根抑制长根206-207190-192shi（tms）抑制长芽抑制长芽202-203187-188traTi质粒转移质粒转移121-12321-30inc质粒不相容性质粒不相容性33-3590-9512PPT课件二、二、T-DNA的基因结构与功能的基因结构与功能1.T-DNA的的发现发现 Chilton等等人人于于1982发发现现。(MDCHILT
11、ON,DTEPFER,APETIT,DCHANTAL,CDFRANCINE,TJACQUES.Agrobacterium rhizogenesinsertsT-DNA into the genomes of the host plant rootcells.Nature,1982(295):432-434）研研究究证证明明，这这部部分分DNA是是从从质质粒粒DNA上上切切割割后后，转转移移到到肿肿瘤瘤细细胞胞，故故称称之之为为转转移移DNA（transferred-DNA）。13PPT课件GGCAGGATATATATTCAATTGTAATGGCAGGATATATATACCGGTTGTAATT图
12、图3-2Ti质粒上几个重要区域及其序列质粒上几个重要区域及其序列LB：左边界序列；：左边界序列；RB：右边界序列：右边界序列14PPT课件2.T-DNA的结构特点的结构特点lTi质粒质粒T-DNA区的长度约为区的长度约为23kb；l lT-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；中；l在在T-DNA的的5端端和和3端端都都有有真真核核表表达达信信号号。如如TATAbox、AATAAbox及及polyA等。等。15PPT课件T-DNA的两端左右边界各为的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序的重复序列，即边界序列（列（bordersequence），分别称之为左边界
13、（），分别称之为左边界（BL或或TL）和右边界（）和右边界（BR或或TR）。该该25bp边界序列属保守序列边界序列属保守序列,但通常右边界（但通常右边界（TR）序列更）序列更为保守，左边界为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心序列在某些情况下有所变化。其核心部分是部分是14bp，可分为，可分为10bp(CACGATATAT)及及4bp(GTAA)两部分两部分,是完全保守的。是完全保守的。致瘤性：右边界作用大于左边界致瘤性：右边界作用大于左边界16PPT课件3.T-DNA上的编码基因及功能上的编码基因及功能T-DNA的转录有下述共同点的转录有下述共同点：T-DNA的两条链都是有意
14、义链的两条链都是有意义链,即都能被转录即都能被转录。T-DNA上每个基因都有各自的启动子上每个基因都有各自的启动子。基因的转录由植物细胞基因的转录由植物细胞RNA聚合酶聚合酶完成完成。T-DNA具典型的真核生物具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号合成起始和终止的调节信号，T-DNA的转录机理可能与真核生物相同的转录机理可能与真核生物相同。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。17PPT课件TLTRTCiaaH iaaMauxiptcytocsfrsmasags图图4-3章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒的质粒的T-DNA编码基因
15、结构编码基因结构iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；：吲哚乙酸胺水解酶；iaaM：色氨酸单加氧酶；：色氨酸单加氧酶；aux：生长素；：生长素；ipt:异戊烯基转移酶；异戊烯基转移酶；cyt：细胞分裂素；：细胞分裂素；frs：琥珀碱合成酶；：琥珀碱合成酶；mas：甘露碱合成酶；：甘露碱合成酶；ags：农杆碱合成酶：农杆碱合成酶18PPT课件T-DNA区基因的功能区基因的功能第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，如如:frs、mas、ags第二类是致瘤基因；包括生长素基因第二类是致瘤基因；包括生长素基因aux和细胞分和细胞分裂素基因裂素基因cyt19PPT课件三、
16、三、Vir区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能1、Vir区操纵子的基因结构：区操纵子的基因结构：农杆菌致瘤所必须的；Vir区仅位于T区DNA左侧；两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异。HABGCDEFtzsABGCDE章鱼碱章鱼碱胭脂碱胭脂碱图图4-5章鱼碱型和胭脂碱型章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒的质粒的Vir区编码基因结构区编码基因结构20PPT课件表表4-4章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒质粒vir基因基本结构与功能基因基本结构与功能遗传座位遗传座位分子量分子量（kb）基因数基因数表达方式表达方式功能功能virA2.81组成型组成型帮助接受植物信号分子启动毒性区表达帮助接受植物信号分子启动毒性区表达virG1.01组成型组成型转录活化转录活化virC1.52诱导型诱导型T-DNA加工加工virD4.54诱导型诱导型T-DNA加工加工virE2.22诱导型诱导型T-DNA加工加工virB9.511诱导型诱导型膜转运蛋白膜转运蛋白virF1.01诱导型诱导型T-DNA转运转运virH94.22诱导型诱导型细胞色素细胞色素P-450单氧化酶单氧化酶21PPT课件三、农三、农杆菌杆
