《（自己整理）实验室常用技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《（自己整理）实验室常用技术（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、本文格式为Word版，下载可任意编辑（自己整理）实验室常用技术 测验室常用技术资料 Lab. experiment technology LQ 细胞冻存 1. 测验前打定：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，参与1.5ml胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，参与少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为平匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液参与冻存管中，离心1000r/min，8分钟。(可以留下一片面细胞悬液
2、在培养瓶中持续培养) 5. 用中枪吸去上清液直至冻存管内剩余1ml培养液，参与110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞平匀。 6. 冷存管置于430min-2030min-801618小时(或隔 夜)-液氮槽长期储存。(-20不成超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。 7记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 冷冻细胞之活化原那么为快速解冻，以制止冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常。 1 材料：3
3、7 恒温水浴箱，崭新培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶 2 步骤： 1、操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 2、自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 3、取出冷冻管，立刻放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部溶解。 4、常温离心1000rpm，5min，以70% 酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内，去除上清夜，参与崭新培养基，重悬细胞。 5、取出细胞悬浮液，缓缓参与有培养基之培养瓶，混合平匀，放入CO2 培养箱培养。 G418和筛选 1、筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的一致
4、浓度的G418的活性不尽一致，所以在筛选之前，确定要确定G418的最正确筛选浓度。 1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量（10000个/ml）接种入24孔培养板中，过夜培养，开头加药。 3.制备筛选培养基：在100ug/ml1000ug/ml范围内确定几个梯度，譬如先做个100ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml、400ug/ml。1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每
5、孔中参与不同浓度的筛选培养基。 5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长处境，每35天更换一次筛选培养基。方法同4。 6.确定最正确筛选浓度：在筛选1014天内能够杀死全体细胞的最小G418浓度即为最正确筛选浓度。一般400-左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 2、确定了最正确筛选浓度后做稳定转染 1、转染：选取对数生长期细胞，接入平皿（4X105个/ml,5ml）,转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近会集时按1：4密度传代，接入12孔板，持续培养，待细胞密度增至5070会集。 2、加G418:去掉培养液，PBS洗一次，参与按最正确筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
6、 3、换液：根据培养基的颜色和细胞生长处境，每35天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选1014天后，可见有抗性的克隆展现，停药培养，待其逐步增大。 4、挑单克隆：显微镜下查看单克隆，参与胰酶消化，将单克隆吸入96孔板（每孔接1个克隆），加培养液持续培养。待其逐步增大后转入到48孔中增殖。（及早冻存） 5、单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。 Lf2000转染：质粒DNA转染 转染前应筛选适合的DNA:Lf2000转染比例。一般按照1:1，2:1，3:1举行筛选。选择转染比率最高者为适合比例。筛选适合的细胞会集度
7、，看高会集度还是低会集度转染效率高。筛选时留神查看最正确转染时间。 以下操作以24孔板为例： 1、 贴壁细胞： 转染前一天，去不含抗生素的培养液500ul接于培养板(细胞密度0.5-2X105个/ml)，转染时细胞融合可到90-95%。 悬浮细胞：打定转染前取即可，取500ul细胞悬液（4-8X105 个/ml），培养液不含抗生素。 2、 打定混合物： A：将DNA稀释于50ulOpti中，轻柔混匀。 B：使用前轻柔混匀Lf2000，取适合剂量用50ulOpti 稀释， 室温放置20min(留神：到stepC时要在25min内完成)。 C：参与A和B，轻柔混匀，室温放置20min. 3、 每孔
8、中参与100ul混合物，前后晃动培养板，轻柔混匀。 4、 培养箱培养18-48h，转然后4-6h换液。 PBS配制 500ml NaCl 4g KCl 0.1g Na2HPO4.12H2O 1.7907g KH2PO4 0.12g 用400ml蒸馏水溶化，HCL/NaOH调PH至7.3-7.4，加水至500ml,高压灭菌。 胰酶配制 1、PBS 500ml 胰酶 1.25g EDTA 0.1g 搅拌4h 2、滤膜、滤纸用双蒸水浸泡2h, 3、装好滤器，勿按紧，包好，晾干后高压。 4、略烤干 5、层流室过滤 6、分装到高压过的小瓶 7、-20C保存备用，同时做无菌试验。 CuSO4配制 2% C
9、uSO4 1500ml 硫酸铜 30g 双蒸水 1500ml 高压灭菌后，将液体倒入37C恒温箱。 双抗配制 青霉素 100u/ml培养液，链霉素100ug/ml培养液 青霉素 100万单位 链霉素 1g PBS 100ml 配制后浓度为10000u/ml，使用时取10ul/ml培养液。 电泳缓冲液TAE配制 贮存液（50X），1 L Tris 碱 242g 冰乙酸 57.1ml 0.5mol/l EDTA(PH8.0) 100ml 加水定容至1L ALB培养基配制（400ml） 细菌培养用蛋白胨 4g 细菌培养用酵母提取物 2g 氯化钠 4g 预先在三角烧瓶中参与200ml双蒸水，将上述配方参与其中，搅拌。 5mol/L NaOH调PH至7.4.，参与双蒸水定容至400ml。取200ml做固体培养基装入A瓶，200ml做液体培养基。 称取3g琼脂参与A瓶。另取一小瓶，参与100ml双蒸水（配氨苄）。 将以上三瓶液体高压，15psi,20min。 配氨苄，过滤除菌。 待A、B瓶冷却至50oC，照100ug/ml浓度的氨苄，每瓶参与200ul，之后将A瓶液体倒入培养皿中，将B瓶和培养皿（倒置）贮存于4 oC。 注：溶液尚未冷却时，轻轻转动，使溶解的琼脂平匀分布，应制止产生气泡。使用前1-2小时应取出贮存的平皿。 7
