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1、DNA第第2代测序技术与遗传学发展代测序技术与遗传学发展一一.DNA第第2代测序技术代测序技术二二.遗传学的发展遗传学的发展三三.第第2代测序技术对遗传学发展的影响代测序技术对遗传学发展的影响1.1 1.1 什么是什么是DNADNA第第2 2代测序技术代测序技术第第2代测序技术（代测序技术（next-generationsequencing）是对传）是对传统统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十万到几百万条万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技术，分子进行序列测定的高通量的测序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组
2、进行细同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。一一.DNA第第2代测序技术代测序技术1.2为什么要发展为什么要发展第第2 2代测序技术代测序技术快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组因组DNA上的遗传信息，
3、进而比较全面地揭示基因组的复上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。角色。1977年年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。生。尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不
4、足，并不是最理想的测序方法。经高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入过不断的开发和测试，进入21世纪后，以世纪后，以Roche公司的公司的454技术、技术、Illumina公司的公司的Solexa技术和技术和ABI公司的公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。技术为标志的第二代测序技术诞生了。1.3 1.3 第第2 2代测序技术的特点代测序技术的特点速度快速度快准确度高准确度高成本低成本低覆盖度深覆盖度深产出巨大产出巨大1.4第第2 2代测序技术代测序技术的原理的原理第第2代测序技术包括代测序技术包括Roche公司的公司的454技术、技术、Illu
5、mina公司公司的的Solexa技术和技术和ABI公司的公司的SOLiD技术。技术。下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介绍。绍。图图1.454测序技术流程测序技术流程454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物技术的主要缺点是无法准确测量同聚物(homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入，而加入T的数目的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。
6、也正是因为这个原因，也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。酸的替换，而是来自插入或缺失。454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。列拼接工作更加高效、准确。图图2.Solexa测序技术流程测序技术流程Solexa技术的读取长度可以达到技术的读取长度可以达到275bp，相比，相比454技术，技术，其后续的序列拼接工作的计算量和难度均大大增加。其后续的序列拼接工作的计算量和难度均大大增加。Solexa技术主要的错误来源是核苷酸的替换，而不是插入技术
7、主要的错误来源是核苷酸的替换，而不是插入或缺失，目前它的错误率大约在或缺失，目前它的错误率大约在1-1.5%之间。之间。Solexa技术每个循环能获得技术每个循环能获得20.5-25Gb的测序结果，耗时的测序结果，耗时约约9.5天。天。Solexa技术在合成中每次只能添加一个技术在合成中每次只能添加一个dNTP，因此很好，因此很好地解决了同聚物长度的准确测量问题。地解决了同聚物长度的准确测量问题。图图3.SOLiD测序技术流程测序技术流程SOLiD技术与技术与Solexa技术类似，后续的序列拼接工作也比技术类似，后续的序列拼接工作也比较复杂。较复杂。SOLiD技术每个循环的数据产出量为技术每个
8、循环的数据产出量为10-15Gb，耗时约为，耗时约为6-7天。天。SOLiD技术每个循环可以测两个上样玻片，读取长度可达技术每个循环可以测两个上样玻片，读取长度可达250bp，而且由于采用两碱基测序，该技术的准确率能，而且由于采用两碱基测序，该技术的准确率能达到达到99.94%以上。以上。1.5 1.5 第第2 2代测序技术的应用代测序技术的应用高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。免了亚克隆过程中引入的偏差。依靠后期强大的生物信息学依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组分析能力，对照一
9、个参比基因组(referencegenome)高通量高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence)。2007年年VanOrsouw等人结合改进的等人结合改进的AFLP技术和技术和454测测序技术对玉米基因组进行了重测序，所发现的超过序技术对玉米基因组进行了重测序，所发现的超过75%的的SNP位点能够用位点能够用SNPWave技术验证，提供了一条对复杂技术验证，提供了一条对复杂基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性分析的技术路线。分析的技术路线。2008年年Hillier对线虫
10、对线虫CB4858品系进行品系进行Solexa重测序，寻重测序，寻找线虫基因组中的找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增。位点和单位点的缺失或扩增。2008年年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了了RNA深度测序。分析测得的序列，有大于深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据的数据显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息通过数据分析展示的是从未被报道过的通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、剪切形式、3端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小端非翻译区、变动的
11、启动子区域以及潜在的小RNA前体。前体。而这些信息无论使用芯片技术还是而这些信息无论使用芯片技术还是SAGE文库测序都是无文库测序都是无法被发现的。法被发现的。高通量测序技术在全基因组高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，表达谱，microRNA表达表达谱，谱，ChIP-chip以及以及DNA甲基化等方面的应用。甲基化等方面的应用。高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编或非编码码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源
12、短序列，高度同源)，而且而且小分子小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据数据“不浪费不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的小分子都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中获得了。在线虫中获得了40万个序列，通过分析发现了万个序列，通过分析发现了18个新的小个新的小RNA分子和一分子和一类全新的小分子类全新的小分子RNA。在在DNA蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀蛋白质相
13、互作用的研究上，染色质免疫沉淀深深度测序度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色质实验也展示了其非常大的潜力。染色质免疫沉淀以后的免疫沉淀以后的DNA直接进行测序，对比直接进行测序，对比refseq可以直可以直接获得蛋白与接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比结合的位点信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。1.6 1.6 第第2 2代测序技术的前景代测序技术的前景大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全
14、取代目前的大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的芯片测序技术。芯片测序技术。新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个“封封闭系统闭系统”，它只能检测人们已知序列的特征，它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变或有限的变异异)。而高通量测序的强项，。而高通量测序的强项，就在于它是一个就在于它是一个“开放系统开放系统”，它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上高于它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上高于芯片技术。芯片技术。新一代测序技术相对传统
15、芯片测序技术的优势，最终还得新一代测序技术相对传统芯片测序技术的优势，最终还得依靠广告和市场营销手段的推广才能获得大众的认可。依靠广告和市场营销手段的推广才能获得大众的认可。近期出现的近期出现的Helicos公司的公司的Heliscope单分子测序仪、单分子测序仪、PacificBiosciences公司的公司的SMRT技术和技术和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子公司正在研究的纳米孔单分子技术，技术，被认为是第三代测序技术。被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，第三代测序技术最大的特点是单分子与前两代技术相比，第三代测序技术最大的特点是单分子测
16、序。测序。二二.遗传学的发展遗传学的发展遗传学（遗传学（genetics）是研究生物遗传与变异的科学；是研）是研究生物遗传与变异的科学；是研究基因的结构、功能及其变异、传递和表达规律的学科。究基因的结构、功能及其变异、传递和表达规律的学科。新石器时代新石器时代人类就已经驯养动物和栽培植物，而后人们逐人类就已经驯养动物和栽培植物，而后人们逐渐学会了改良动植物品种的方法。渐学会了改良动植物品种的方法。改良品种的活动从那时以后从未中断。但是，直到改良品种的活动从那时以后从未中断。但是，直到18世纪世纪下半叶和下半叶和19世纪下半叶世纪下半叶，才由拉马克和达尔文对生物界遗，才由拉马克和达尔文对生物界遗传和变异进行了传和变异进行了系统的研究系统的研究。真正系统研究真正系统研究生物的遗传和变异是从孟德尔开始的。生物的遗传和变异是从孟德尔开始的。孟德尔于孟德尔于1866年年发表了论文发表了论文植物杂交试验植物杂交试验，首次提出，首次提出分离和独立分配两个遗传规律，并认为性状遗传是受细胞分离和独立分配两个遗传规律，并认为性状遗传是受细胞里的遗传因子控制的。里的遗传因子控制的。但是，孟德尔的这一重要理论
