《分子生物学常用技术凝胶电泳》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学常用技术凝胶电泳（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、（优选）分子生物学常用技术凝胶电泳1页，共38页，星期二。电泳技术电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子样品中各种分子带电性质带电性质以及分子以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道2页，共38页，星期二。二、主要方法有支持物的电泳技术： 1 1、纸上电泳、纸上电泳 2 2、醋酸纤维薄膜电泳、醋酸纤维薄膜电泳 3 3、薄层电泳、薄层电泳 4 4、非凝胶性支持体区带电泳、非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等（支持体有
2、：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等) )5 5、凝胶支持体区带电泳、凝胶支持体区带电泳 淀粉液淀粉液 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道3页，共38页，星期二。不用支持体的电泳技术： 1 1、TiseliusTiselius电泳电泳 2 2、显微电泳、显微电泳 3 3、等电点聚焦电泳技术、等电点聚焦电泳技术 4 4、等速电泳技术、等速电泳技术 5 5、密度梯度电泳、密度梯度电泳德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道4页，共38页，星期二。DNADNA电泳泳德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道5页，共38页，星期二。DNA分子带负电，向正电方向游
3、泳德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道6页，共38页，星期二。（一）琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳n n琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度于琼脂糖的浓度n nDNADNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应电荷效应和和分子筛效应分子筛效应n n在碱性缓冲液中在碱性缓冲液中DNADNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链磷酸骨架在结构上的重复性质，相同
4、数量的双链DNADNA几乎具有等量的净电几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动n n在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNADNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNADNA分分子本身的大小和构型子本身的大小和构型n n琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNADNA，也可以分离相对分子质，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的量相同，但构型不同的DNADNA分子分子n n可以分离长度为可以分离长度为100bp100bp至近至近60kb60
5、kb的的DNADNA分子，常采用分子，常采用TAETAE、TBETBE和和TPETPE三种缓冲三种缓冲体系体系德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道7页，共38页，星期二。琼脂糖脂糖Agarose琼脂糖为链状多糖琼脂糖为链状多糖琼脂糖为链状多糖琼脂糖为链状多糖绳状琼脂糖束绳状琼脂糖束绳状琼脂糖束绳状琼脂糖束大网孔型大网孔型大网孔型大网孔型Meltingat85andsolidifyingfrom32-40D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactopyranose. 德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道8页，共38页，星期二。不同浓度琼脂糖分离不同浓度琼脂糖分离DN
6、A分子的范围分子的范围琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（%） 分离范围（分离范围（分离范围（分离范围（kbkb） 0.3 5-600.3 5-60 0.6 1-20 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 2.0 0.1-3德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道9页，共38页，星期二。琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（%） 分离范围（分离范围（kb）0.51.030300.70.8121.00.5101.20.471.50.23 3
7、2.00.052德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道10页，共38页，星期二。n n质粒质粒DNADNA分子有三种构型，即分子有三种构型，即CCCDNACCCDNA、OCDNAOCDNA和和LDNALDNA，这三种构型的质粒，这三种构型的质粒DNADNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，此电泳后呈三条带，CCCDNACCCDNA泳动最快，泳动最快，其次是其次是LDNALDNA，最慢的是，最慢的是OCDNAOCDNAn nEBEB：即溴化乙锭，它能够插入：即溴化乙锭，它能够插入DNADNA分分子中的碱基对之间而与子中的碱基对之间而与DNADNA结合
8、。由于结合。由于EBEB分子的插入，在紫外光的照射下，凝分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的胶电泳中的DNADNA条带呈现出红色荧光，易条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测于检测。可以检测10ng 10ng 的的DNADNAn n注意：注意：EBEB是一种诱变剂，操作时一定要注是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套意安全，必须戴塑料或乳胶手套CCCDNALDNAOCDNA电泳方向德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道11页，共38页，星期二。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型1 1当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时
9、，称之为共价闭合环形时，称之为共价闭合环形DNADNA（cccDNAcccDNA），），这样的这样的DNADNA通常呈现超螺旋的通常呈现超螺旋的SCSC构型；构型；2 2如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环称之为开环DNADNA（ocDNAocDNA），此即），此即OCOC构型；构型；3 3若质粒若质粒DNADNA经过适当的核酸内切限制酶切经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNAIDNA），通称），通称
10、L L构型。构型。德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道12页，共38页，星期二。琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNA的观察的观察溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）DNADNA：紫外光下：紫外光下：紫外光下：紫外光下 红色荧光红色荧光红色荧光红色荧光德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道13页，共38页，星期二。琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳主要实验器材主要实验器材电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽缓冲液缓冲液琼脂糖琼脂糖凝胶槽凝胶槽梳子梳子取液器取液器溴酚蓝溴酚蓝德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道14页，共38页，星期二。电泳槽结构电泳槽结构德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道15页，共38页，星期
11、二。操作步骤操作步骤 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EBEB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶凝胶板的制备：加梳子，倒胶凝胶板的制备：加梳子，倒胶凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品样品的制备：样品样品的制备：样品样品的制备：样品+1/5+1/5体积溴酚蓝体积溴酚蓝体积溴酚蓝体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑）加样：加样端为负极（黑）加样：加样端为负极（黑）加样：加样端为负极（黑） 电泳：电泳：电泳：电泳：5V/cm5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相观察：紫外灯下观察，照相观察：紫外灯下观察，照相观察
12、：紫外灯下观察，照相德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道16页，共38页，星期二。溶溶 胶胶德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道17页，共38页，星期二。准备胶槽准备胶槽德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道18页，共38页，星期二。凝胶冷却至凝胶冷却至凝胶冷却至凝胶冷却至5050CC，加，加，加，加EBEB至终浓度至终浓度至终浓度至终浓度0.50.5g/mlg/ml德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道19页，共38页，星期二。铺铺 胶胶德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道20页，共38页，星期二。凝胶凝固后取出梳子凝胶凝固后取出梳子德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道21页，共38页，星期二。
13、加缓冲液加缓冲液德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道22页，共38页，星期二。准备样品准备样品德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道23页，共38页，星期二。点点 样样德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道24页，共38页，星期二。电电 泳泳德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道25页，共38页，星期二。注意观察溴酚蓝染液的迁移注意观察溴酚蓝染液的迁移德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道26页，共38页，星期二。紫外灯下观察电泳结果紫外灯下观察电泳结果德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道27页，共38页，星期二。照照 相相德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道28页，共38页，星期二。（二）聚丙烯酰胺
14、凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMEDTEMED的作用下聚合而成的作用下聚合而成可以分离小片段（可以分离小片段（5 5500bp500bp）DNADNA分子分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：蛋白质分子的分离鉴定蛋白质分子的分离鉴定蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定核酸的分析核酸的分析核酸序列测定核酸序列测定德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道29页，共38页，星期二。德厚行远，因尔成道德厚行远，因
15、尔成道30页，共38页，星期二。迷你垂直型电泳槽德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道31页，共38页，星期二。DNA序列分析电泳槽德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道32页，共38页，星期二。中型双垂直电泳槽德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道33页，共38页，星期二。蛋白蛋白电泳泳德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道34页，共38页，星期二。（三）醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样
16、品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5g的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道35页，共38页，星期二。（四）等电聚焦电泳技术（四）等电聚焦电泳技术等电聚焦（等电聚焦（isoelectricfocusingisoelectricfocusing，IEFIEF）是）是6060年代年代中期问世的一种利用有中期问世的一种利用有pHpH梯度的介质分离等电点不同的梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH0.01pH单位，单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。质组分。 现在它经常与现在它经常与SDS-SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳构成二聚丙烯酰氨凝胶电泳构成二维电泳中的第一向，主要用于分离蛋白质。维电泳中的第一向，主要用于分离蛋白质。德厚行远，因尔成道德厚行远，因尔成道36页，共38页，星期二。IEF的基本原理n n在在IEFIEF的电泳中，具有的电泳中，具有pHpH梯度的介质其分布是从
