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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑基因工程复习整理资料 第一章 重组DNA技术：将一种生物体（供体）的基因与载体在体外举行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 基因工程：重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）； 下游技术那么涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分开纯化过程。 遗传工程：采用基因工程方法和技术人工改造生物遗传性，细胞融合，花粉培育，常规育种、有性杂交。 生物工程：包括基因工程、细胞工程
2、、酶工程、发酵工程（生化工程）、蛋白质工程 基因工程的三大理论根基： 1. 生物的遗传物质是DNA 2. 明确了DNA的双螺旋布局、中心法那么 3 遗传密码子的破译 基因工程的三大技术研发：限制性内切酶和连接酶：DNA的“手术刀”与“缝纫机” 载体：输送遗传物质的工具，如质粒、病毒等 逆转录酶：从mRNA到 DNA，使真核基因制备成为可能 基因工程研究内容： 目的基因的获得 目的基因与载体的连接成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 筛选重组克隆 基因表达与产物分开 其次章 基因工程根本操作技术：核酸的凝胶电泳，PCR技术，分子杂交，基因突变技术。 1、PCR (polymerase c
3、hain reaction) 技术 变性 变性不完全：导致PCR失败，未完全变性的双链DNA会很快复性，裁减DNA产量； 变性时间过长或温度过高：导致聚合酶活性下降，扩增效率降低 Taq酶活性的半衰期为：92.5度130 min; 95度40 min; 97度5min 退火 引物退火的温度和所需时间取决于引物的碱基组成、引物的长度，引物与模板的匹配程度及引物的浓度。 退火温度越高，所得产物的特异性也越高 实际使用的退火温度双扩增引物的Tm值低5-10度 退火温度的选择 两条引物间的Tm值相差小于5，最好1。 退火温度以两条引物中Tm值较低的为准，并且低5-10 Tm=（A+ T）X2+（C+
4、G）X4+ 3.3 A T C G指引物与模板直接配对的片面，外加碱基不算。 延迟 延迟回响通常在72度举行，接近Taq酶的最适温度75度。 在一般回响体系中， Taq酶每分钟可以合成约2kb长的DNA片段。 在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延迟时间，裁减Taq酶活性的损失。 （1）引物（P31） DNA聚合酶需要一小段双链DNA来启动新链的合成。 所谓PCR扩增引物，是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段，其长度在1530个核苷酸之间。 上游引物，是与基因的5?端互补的寡核苷酸，用于扩增编码链； 下游引物，是与基因的3?端一致的寡核苷酸，用于扩增DNA模板链。 两
5、引物在模板DNA上结合之间的距离抉择了扩增区段的长度。 测验说明，1kb之内是梦想的扩增长度；2kb是有效的扩增长度；3kb以上那么难上有效的扩增。 设计引物的根本原那么 引物长度：15-30 b，指模版与引物相配对的碱基数；应随机排列，制止同一碱基串联。 e.g. 引物长度为8个核苷酸：4865 536 bp 43 000个可能 17个核苷酸：41717 179 869 184 bp 超过5倍 人类基因组DNA长度：3109 bp 可以在5?端加适量的养护碱基或酶切位点序列 理由：5?端的无关序列不会影响引物特异序列的退火 引物的3?末端和模板的碱基要完全配对 防止引物对间及引物内的同源性，
6、尤其是3?端不能展现碱基同源，3?最好不展现碱基A GC的合理含量（P32）与Tm值的范围 目的：?ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3? 上游序列：? ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC ? G+C含量=？% 下游序列：?CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3? G+C含量=？% 引物的设计软件： Oligo 6, Premier Primer, DNAstar, FastPCR etc. 其他概念：简并引物，嵌套引物 2、反转录 PCR(RT
7、-PCR) 反转录PCR：先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。 mRNA-cDNA-PCR 抽提RNA 、反转录合成cDNA、PCR 扩增 3、实时荧光定量PCR 在PCR回响体系中参与荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，结果通过标准曲线对未知模板举行定量分析的方法 实时PCR技术原理 4、巢式PCR（nested PCR） 巢式PCR（nested PCR）是一种PCR革新模式，它使用巢式PCR引物来巩固回响的敏感性和特异性，巢式PCR方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对外引物产生扩增产物，然后用一对内引物
8、对第一轮扩增产物举行其次轮扩增。 5、RACE技术 RACE是基于PCR技术根基上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延迟扩增从而获得完整的3端和5端的方法 分为5?-RACE和3?- RACE 5 RACE原理 5?-RACE的原理是先是利用mRNA的3?末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30作为锁定引物在反转录酶MMLV（或AMV）作用下，反转录合成标准第一链cDNA。 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达成第一链的5?末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以
9、SMART序列为模板持续延迟而连上通用接头。 然后用一个含有片面接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物2作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，举行PCR循环，把目的基因5?末端的cDNA片段扩增出来 3 RACE原理 利用mRNA的3?末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。 然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有片面接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以cDNA第一链为模板，举行PCR循环，把目的基因3?末端的DNA片段扩增出 6、
10、常用的分子杂交有哪些？ （1）Southern印记杂交 （2）Nouthern印记杂交 (3) 菌落原位杂交 （4）组织原位杂交 （5）斑点杂交 （6）Western blotting 第三章 同裂酶:识别同一序列且在同一位置(有时不)切割DNA的内切酶。 同尾酶:识别并切割不同序列但酶切产生互补末端的内切酶。 连接酶：在E.coli和动植物细胞中都有。能催化DNA中相邻的3-OH和5-P之间形成磷酸二脂键。 （用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源：一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶。 另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。） 核酸酶S1：从米曲
11、霉中提纯得到的一种金属蛋白，是单链特异性核酸酶，能降解单链DNA或RNA （用途：(1)分析RNADNA杂合布局；(2)除去DNA的单链末端，生成平端； (3)切断双链DNA 的发夹布局。） 逆转录酶：以RNA为模板的DNA聚合酶，来源于鼠（MLV）和禽类（AMV）的反转录病毒。由两 条肽链组成，具有5?3?聚合酶和RNaseH活性(P55）。 RNaseH： 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便其次 条链cDNA链的合成。 DNA聚合酶：催化以DNA为模板合成DNA的回响. 特点: (1)以dNTPs作底物；(2)有模板存在；(3)有引物存在；(4
12、)新链合成方向为5?3?一分子的核苷酸的3?-位羟基与另一分子核苷酸的5?-位磷酸基通过脱水可形成3?,5?-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。 DNA甲基化酶：同限制性内切酶具有完全一致的识别依次，甲基化酶使识别依次中的某个碱基 发生甲基化，养护DNA不被限制性内切酶切开。 1. dcm 和dam甲基化酶对限制酶的影响 1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别依次是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠 BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG) 边界重叠 ClaI-dam； Sau96I-dcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别依次为何种重叠 如：da
13、m-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm-BstNI 限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在相关位置切割 DNA双链布局的核酸内切酶。 核酸酶可分为核算外切酶和核酸内切酶 核酸外切酶：以核酸分子的末端为酶解部位逐个降解核苷酸 核酸内切酶：从核酸分子内部水解磷酸二酯键使之断裂成小片段 限制性酶的类别与活性 型酶 型酶 型酶 蛋白布局 内切酶亚基和甲基2亚基的双功3亚基的双功能酶 化酶亚基分开 能酶 识别位点 46bp序列 57bp 两侧对称或不对称 常为回文 不对称序列 剪切位点 在限制位点 限制位点上游 离限制位点 1000 2426bp处
14、bp的非特异位点 限同时存在 彼此排斥 制与甲活性分开 基化 基因工程中最常用的是型酶 绝大多数型酶可以识别4-8个核苷酸的特异序列，这些序列可以是连续的也可以休止的。大多识别序列呈180。旋转对称或二重互补对称，也成回文布局。 限制酶识别序列的相邻序列效应（P48）：即大多数限制性内切酶对只含识别序列的寡核苷酸没有催化活性，需在两侧各延长一个或几个核苷酸才能被有效酶切 应用：设计引物时加养护碱基。 限制酶的位点偏爱性:限制性核酸酶的切割效率与酶切位点侧翼序列的核苷酸组成有关。 星活性是指某些限制性核酸内切酶在不适的环境中其识别序列发生变更的现象 第四章 载体：能携带外源基因导入受体细胞，这种运载工具称载体。 1.克隆载体: 具组装、复制、扩增功能。如：pBR322、pUC18/19等。 2.表达载体: 不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如pBV220、pKK223-3 (按
