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1、微生物工程发酵第三章培养基制备与灭菌详解演示文稿1页，共54页，星期四。（优选）微生物工程发酵第三章培养基制备与灭菌2页，共54页，星期四。按纯度按纯度 合成培养基合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定原料其化学成分明确、稳定 q 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 q 培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业 生产生产 天然培养基天然培养基: 采用天然原料采用天然原料 q 原料来源丰富原料来源丰富(大多为农副产品大多为农副产品)、价格低廉、适于工业、价格低廉、适于工业 化生产化生产 q 原
2、料质量等方面不加控制会影响生产稳定性原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 培养基概述培养基概述3页，共54页，星期四。固体培养基固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 半固体培养基半固体培养基: :即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为量为0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定。主要用于微生物的鉴定。液体培养基液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成是水，其中配有可溶性的或不溶
3、性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。分，是发酵工业大规模使用的培养基。 4页，共54页，星期四。根据生根据生产流程和作用来区分流程和作用来区分斜面培养基或孢子培养基种子培养基发酵培养基5页，共54页，星期四。3.1 发酵培养基组成及来源五大元素：水、碳源、氮源、无机盐、生长因子6页，共54页，星期四。3.1.1 五大营养要素及其主要来源3.1.1.1 水分：占细胞重量的80-90%； 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大 水源质量的
4、主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。污染程度以及矿物质组成和含量。 7页，共54页，星期四。3.1.1.2 碳源可以作为微生物细胞和代谢产物中碳素来源的营养物质；8页，共54页，星期四。a. 纯糖原料葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等9页，共54页，星期四。b. 淀粉质原料 直链淀粉（聚合度 100-6000）支链淀粉 （1000-3000000）10页，共54页，星期四。薯类原料：红薯、木薯；谷物原料：玉米野生植物原料：橡果、葛根、蕨根辅助原料：麸皮、米糠11页，共54页，星期四。 淀粉、糊精淀粉、糊精使用条件
5、：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、缺点：难利用、 发酵液比较稠、一般发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的时加入一定的-淀粉酶，淀粉酶， 成分比较复杂等等。成分比较复杂等等。优点：来源广泛、价格底优点：来源广泛、价格底 可以解除葡萄糖效应可以解除葡萄糖效应12页，共54页，星期四。c. 糖蜜原料：制糖工业中的副产物；甘蔗、甜菜13页，共54页，星期四。糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，许多都会对发酵产生不利的影除糖份外，含有较多的杂质，许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。响，需要进行预处理。例
6、：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）生物素（发酵控制）例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）14页，共54页，星期四。d. 纤维质原料：农作物秸秆；纤维素、半纤维素、木质素15页，共54页，星期四。3.1.1.3 氮源被微生物利用以构成细胞物质或代谢产物中的氮素的营养物质；16页，共54页，星期四。a. 无机氮源氨水、硝酸盐、铵盐特点：吸收快，速效氮源。但无机氮源的迅速利特点：吸收快，速效氮源。但无机氮源的迅速利用常
7、会引起用常会引起pH的的变化如：化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 满足菌体生足菌体生长 稳定和定和调节发酵酵过程中的程中的pH17页，共54页，星期四。b. 有机氮源玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、鱼粉、酵母浸出液成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。盐及生长因子。例例 玉米浆：玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸较多的乳酸 硫、磷、微量元素等硫、磷、微量元素等18页
8、，共54页，星期四。 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响19页，共54页，星期四。3.1.1.4 无机盐酶活中心的活中心的组成部分成部分维持生物大分子和持生物大分子和细胞胞结构的构的稳定性定性调节并并维持持细胞的渗透胞的渗透压平衡平衡控制控制细胞的氧化胞的氧化还原原电位位作作为某些微生物生某些微生物生长的能源物的能源物质20页，共54页，星期四。3.1.1.5 生长因子凡是微生物生凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、，如氨基酸、嘌呤、呤、嘧啶
9、、维生素等均生素等均称生称生长因子。因子。有机氮源是生有机氮源是生长因子的重要来源；因子的重要来源；21页，共54页，星期四。3.1.1.6 前体物质、抑制剂和促进剂 前前体体物物质质指指某某些些化化合合物物加加入入到到发发酵酵培培养养基基中中，能能直直接接彼彼微微生生物物在在生生物物合合成成过过程程中中合合成成到到产产物物物物分分子子中中去去，而而其其自自身身的的结结构构并并没没有有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分子量分子量13622页，共54页，星期四。 前体一般都有毒
10、性，前体一般都有毒性，浓度度过大大对菌体的生菌体的生长不利不利 苯乙酸，一般基苯乙酸，一般基础料中料中仅仅添加添加0.07% 前体相前体相对价格价格较高，添加高，添加过多，容易引多，容易引起起挥发和氧化和氧化23页，共54页，星期四。3、产物促进剂、产物促进剂 产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂后却能提高产量的添加剂24页，共54页，星期四。 促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。 有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本
11、身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。25页，共54页，星期四。抑制剂：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白质抑制剂：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白质变性的物质；变性的物质；可用透析或超滤的方式去除；可用透析或超滤的方式去除； 在培养基中添加抑制剂会抑制某些代
12、谢途径的进行，在培养基中添加抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需要同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某一终产物或使正常代谢的某一代谢中间产物积的某一终产物或使正常代谢的某一代谢中间产物积累起来累起来;26页，共54页，星期四。3.1.2 发酵工业原料的选择原则因地制宜，就地取材；因地制宜，就地取材；营养丰富，养丰富，浓度恰当；度恰当；资源丰富，容易收集；源丰富，容易收集；易于易于储藏；藏；理化性理化性质稳定，成分定，成分间无反无反应；不影响通气、不影响通气、搅拌、拌、产物分离，物分离，废物物处理方便理方便不含毒副作用的物不含毒副作用的物质价格低
13、廉价格低廉27页，共54页，星期四。3.1.4 原料的预处理和加工淀粉质原料的预处理和加工预处理：原料除杂、粉碎；加工：液化 淀粉糊精、低聚糖 糖化 产生葡萄糖28页，共54页，星期四。加工：糊化、液化 淀粉糊精、低聚糖 糖化 产生葡萄糖淀粉颗粒受热并吸水膨胀，体积迅速增大，固态结构被破坏，形成粘稠的液体，称为糊化；糊化的淀粉在酶的作用下，分子链被切断，相对分子量变小，粘度迅速降低的过程称为液化；经液化后的料液中加入一定量的糖化酶（葡萄糖淀粉酶），使糊精或低聚糖水解为葡萄糖，称之为糖化。29页，共54页，星期四。30页，共54页，星期四。糖蜜原料的预处理去除杂质、胶体、灰分（钙质）及产酸细菌；
14、方法：加酸酸化； 加热灭菌； 静止沉淀； 脱钙；31页，共54页，星期四。纤维素原料的预处理及加工：预处理： 用化学、物理、生物学的方法，去除半纤维素和木质素，破坏纤维素的结构；加工： 酸水解 酶水解32页，共54页，星期四。3.2 发酵培养基的设计和优化目前目前还不能完全从生化反不能完全从生化反应的基本原理来的基本原理来推断和推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、只能用生物化学、细胞生物学、微生物学胞生物学、微生物学等的基本理等的基本理论，参照前人所使用的，参照前人所使用的较适合适合某一某一类菌种的菌种的经验配方，再配方，再结合所用菌种合所用菌种
15、和和产品的特性，采用品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型瓶、玻璃罐等小型发酵酵设备，按照一定的，按照一定的实验设计和和实验方方法法选择出出较为适合的培养基适合的培养基33页，共54页，星期四。3.2.1发酵培养基酵培养基设计的基本原的基本原则根据生根据生产菌株的菌株的营养特征配置培养基；养特征配置培养基；营养成分的配比适当；养成分的配比适当；渗透渗透压适宜适宜pH值适当适当各成分的加入次序及步各成分的加入次序及步骤适当；适当；34页，共54页，星期四。3.2.3 发酵培养基酵培养基设计和和优化步化步骤 各成分最适的浓度（正交实验设计）各成分最适的浓度（正交实验设计） 根据前人的经验和培养基成分初步
16、确定可能的培养基成分；根据前人的经验和培养基成分初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；35页，共54页，星期四。类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健36页，共54页，星期四。原培养基:37页，共54页，星期四。 初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)38页，共54页，星期四。 通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好39页，共54页，星期四。结果：碳源：乙酸钠 0. 2%氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏0.03%无机盐: 复合无机盐0.05%40页，共54页，星期四。 正交设计确定优化的配方41页，共54页，星期四。42页，共54页，星期四。改进后培养基的发酵结果43页，共54页，星期四。例： 青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8% 轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8% 补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和罐的基
