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1、毛细管电泳分离原理及分析策略毛细管电泳分离原理及分析策略贝克曼高效毛细管电泳仪贝克曼高效毛细管电泳仪毛细管电泳是带电粒毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进或和分配系数不同进行高效、快速分离的行高效、快速分离的电泳新技术，也称为电泳新技术，也称为高效毛细管电泳高效毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, Capillary Electrophoresis, CECE)。 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理1 1 装置装置装置装置 毛细管毛细管毛细管毛细管 数据处理数据处理数据处理数据处理 电极电极电
2、极电极 检测器检测器检测器检测器 电极电极电极电极 试样试样试样试样 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 高压电源高压电源高压电源高压电源 （可高至（可高至（可高至（可高至30303030KVKVKVKV） 2 2 电电泳和泳和电电渗渗 电电泳泳泳泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。现象。现象。现象。电电渗渗渗渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿是
3、指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。固体表面移动的现象。固体表面移动的现象。固体表面移动的现象。 2 2 电电泳和泳和电电渗渗 电泳泳行行行行为为与与与与特特特特性性性性使使使使用用用用淌淌淌淌度度度度描描描描述述述述 即即即即单单单单位位位位场场场场强强强强( ( ( (E E E E) ) ) )下下下下离离离离子子子子的的的的平平平平均电泳速度均电泳速度均电泳速度均电泳速度 ep=/E实验实验中，只中，只中，只中，只发发生生生生电电泳泳泳泳时时有效淌度有效淌度有效淌度有效淌度 ef ef =ef ef (L /V)(L /V) =( =( l / tl / t
4、mm ) ) (L /V)(L /V) 毛毛毛毛细细管有效管有效管有效管有效长长度度度度 迁移时间迁移时间迁移时间迁移时间 毛细管总长度毛细管总长度毛细管总长度毛细管总长度 电压电压电压电压 2 2 电电泳和泳和电电渗渗 电渗渗与固液界面的双与固液界面的双与固液界面的双与固液界面的双电层电层有着密切的关系有着密切的关系有着密切的关系有着密切的关系 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电
5、场作用下，负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（electroosmotic electroosmotic flow ,EOFfl
6、ow ,EOF）。）。）。）。 固液两相间的固液两相间的总电势总电势-热力学热力学电势电势-0 Zeta电势电势- 2 2 电电泳和泳和电电渗渗 电渗流的流型特点渗流的流型特点电渗流电渗流电渗流电渗流 HPLCHPLCHPLCHPLC塞流塞流塞流塞流 层流层流层流层流 2 2 电电泳和泳和电电渗渗 电渗流的表示渗流的表示电电渗流的大小可用淌度渗流的大小可用淌度渗流的大小可用淌度渗流的大小可用淌度( ( eoeo) )或或或或电电渗流系数表示渗流系数表示渗流系数表示渗流系数表示 eo =eo / E = l /( teoE )电渗流速度电渗流速度电渗流速度电渗流速度 毛细管有效长度毛细管有效长度
7、毛细管有效长度毛细管有效长度 电渗流流出时间电渗流流出时间电渗流流出时间电渗流流出时间 电场强度电场强度电场强度电场强度 第第2222章章 毛毛细细管管电电泳泳 22221 1 毛毛细细管管电电泳的原理泳的原理2 2 电电泳和泳和电电渗渗 电渗流的意渗流的意义1.1.1.1.电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象2.2.2.2.电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快5 5 5 57 7 7 7倍倍倍倍3.3.3.3.利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，利用电
8、渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析分离分析分离分析分离分析电渗流是毛细管电泳分离的重要参数电渗流是毛细管电泳分离的重要参数电渗流是毛细管电泳分离的重要参数电渗流是毛细管电泳分离的重要参数控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离控制电渗
9、流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。的效率、重现性、分离度。的效率、重现性、分离度。的效率、重现性、分离度。 分情况而论2 2 电电泳和泳和电电渗渗 改改变电渗流的方法渗流的方法1.1.改变外加径向电场改变外加径向电场改变外加径向电场改变外加径向电场2.2.改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液成分和浓度 ZetaZeta电势电势电势电势3.3.改变缓冲液改变缓冲液改变缓冲液改变缓冲液pHpHpHpH4.4.加入添加剂加入添加剂加入添加剂加入添加剂5.5.改变温度改变温度改变温度改变温度 粘度粘
10、度 盐盐-离子强度离子强度表面活性剂表面活性剂eo正比于正比于Zeta电势和介质的介电常数介电常数 反比于介质的黏度介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度双电层厚度和界面有效电荷密度界面有效电荷密度 反比于介质的介电常数介电常数表表观电观电泳淌度泳淌度 apapap=ap/E ap为离子的表观迁移速度为离子的表观迁移速度 ap=ef +eo ap= ef + eo2 2 电电泳和泳和电电渗渗 3 3 分离效率和分离度分离效率和分离度 分离效率分离效率分离效率分离效率柱效可以用理柱效可以用理柱效可以用理柱效可以用理论论塔板数塔板数塔板数塔板数n n表示表示表示表示 n n = ( = ( epe
11、p+ + eoeo) ) V l V l /(2/(2DLDL) ) 毛细管电泳分离的柱效方程毛细管电泳分离的柱效方程毛细管电泳分离的柱效方程毛细管电泳分离的柱效方程 理理理理论论塔板高塔板高塔板高塔板高 H =L / n H =L / n n n = 5.54( = 5.54( / / W W) )2 2 实验实验上可按上式求出理上可按上式求出理上可按上式求出理上可按上式求出理论论塔板数塔板数塔板数塔板数 为电泳图上从为电泳图上从为电泳图上从为电泳图上从起点起点起点起点至电泳至电泳至电泳至电泳峰最大值峰最大值峰最大值峰最大值之间的距离之间的距离之间的距离之间的距离 W W W W为电泳峰的为
12、电泳峰的为电泳峰的为电泳峰的半高峰宽半高峰宽半高峰宽半高峰宽 3 3 分离效率和分离度分离效率和分离度 分离度分离度电电泳泳泳泳中中中中两两两两峰峰峰峰的的的的分分分分离离离离度度度度（R Rs s），也也也也称称称称为为分分分分辨辨辨辨率率率率，它它它它表表表表示示示示了了了了淌度相近的淌度相近的淌度相近的淌度相近的组组分分分分分开的能力，可表达分开的能力，可表达分开的能力，可表达分开的能力，可表达为为 R Rs s= = （n n 1/21/2/ /4 4） （ / / 平平平平 ）相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差平平平平为两者的平均
13、速度为两者的平均速度为两者的平均速度为两者的平均速度 / / / / 平平平平表示分离选择性表示分离选择性表示分离选择性表示分离选择性n n n n为柱效为柱效为柱效为柱效分离度分离度计算式算式Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 )t tm1m1、t tm2 m2 分别为两个组份的迁移时间分别为两个组份的迁移时间分别为两个组份的迁移时间分别为两个组份的迁移时间WW 为为为为峰底的宽度峰底的宽度峰底的宽度峰底的宽度 3 3 分离效率和分离度分离效率和分离度 4 4 区区带宽带宽度及其展度及其展宽宽因素因素 区区带宽度度展展宽因素因素 1.焦耳焦耳热 2.进样3.电泳泳
14、扩散散4.毛毛细管壁管壁对组分的吸附分的吸附 焦耳焦耳焦耳焦耳热热 细内径（细内径（细内径（细内径（100100mm），），），），粗外径的毛细管柱粗外径的毛细管柱粗外径的毛细管柱粗外径的毛细管柱 温度轮廓温度轮廓 - 黏度轮廓黏度轮廓 -速度轮廓速度轮廓4 4 区区带宽带宽度及其展度及其展宽宽因素因素 进样进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。 细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。细内径的毛细管柱时
15、，进样操作的要求更为严格。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。 一般进样区带控制在柱长的一般进样区带控制在柱长的1%1%电电泳泳扩扩散散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区
16、带电分散。 s s-b b 峰前展或拖尾？峰前展或拖尾？4 4 区区带宽带宽度及其展度及其展宽宽因素因素 毛毛细管壁管壁对组分的吸附分的吸附 电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：抑制吸附作用常用的方法有：抑制吸附作用常用的方法有：抑制吸附作用常用的方法有： 使用极端使用极端使用极端使用极端pHpHpHpH条件条件条件条件 加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物 对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理 需要注意：方法也会抑制或改变电渗流需要注意：方法也会抑制或改变电渗流需要注意：方法也会抑制或改变电渗流需要注意：方法也会抑制或改变电渗流 4 4 区区带宽带宽度及其展度及其展宽宽因素因素 CE分离原理分离原理-与模式有关与模式有关毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZECZE）毛细管胶束电动色谱（毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKCMECC/MCKC）毛细管凝胶电泳（
