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1、基因转染技术及其应用简介演示文稿1页，共48页，星期四。基因转染技术及其应用简介2页，共48页，星期四。1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。一、基因转染简介一、基因转染简介3页，共48页，星期四。二、基因转染的基本方法二、基因转染的基本方法(一一)重组子构建重组子构建(二二)基因转染真核细胞的基本方法基因转染真核细胞的基本方法4页，共48页，星期四。(一一)重组子构建重组子构建1.目的基因的制备和获取目的基因的制备和获取2. 哺乳动物细胞哺乳动物细胞表达载体的选择表达载体的选择3. DNA片
2、断的重组连接片断的重组连接4. DNA重组体的鉴定重组体的鉴定5页，共48页，星期四。(1)目的基因目的基因 是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段(2)目的基因常用的制备方法目的基因常用的制备方法 1.目的基因的制备和获取目的基因的制备和获取6页，共48页，星期四。A.限制酶切除限制酶切除 a.从原核基因组DNA制备视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。 b. 从真核基因组从真核基因组DNA制备制备 c.从已克隆的从已克隆的DNA片段制备片段制备7页，共48页，星期四。B.B. PCRPCR或或RT/PCRRT/PCR方法制备目的基因方法制备目的基因a.
3、获取已知基因获取已知基因 据据已已发发表表的的基基因因序序列列（或或基基因因两两侧侧序序列列已已知知） 设设计计/ /合合成成一一对对引引物物 PCRPCR（基基因因组组DNADNA为为模模板板）/RT-PCR(mRNA/RT-PCR(mRNA为为模模板板) ) 从从组组织或细胞制备目的基因织或细胞制备目的基因b.b. 构建构建RT/PCRRT/PCR文库法获取未知基因文库法获取未知基因 据据mRNAmRNA末末端端如如polyApolyA尾尾设设计计共共同同引引物物 将将所所用用mRNAmRNA并并逆逆转转录录成成cDNAcDNA利利用用工工具具酶酶在在cDNAcDNA末末端端加加尾尾 采采
4、用用一一对对共共用用引引物物扩扩增增所所有有cDNAcDNA，插入适当载体插入适当载体 构成构成PCRcDNA文库筛选文库筛选8页，共48页，星期四。C.计计算算机机克克隆隆即即利利用用GenBank信信息息，利利用用不不同同种种属属同同源源性性设设计计引引物物，尝尝试试获获取取未未知知基基因因片片段段，这这有有赖赖于各种计算机软件的应用。于各种计算机软件的应用。D.化化学学合合成成法法制制备备基基因因片片段段用用DNA合合成成仪仪，对对目目的的基基因因分分段段合合成成，连连接接，可可以以得得到到所所需需的的目目的的基基因。因。9页，共48页，星期四。2.哺乳动物细胞哺乳动物细胞表达载体的选择
5、表达载体的选择哺乳动物细胞表达载体有哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体大类：质粒型载体和病毒型载体（1）质粒型载体）质粒型载体 哺哺乳乳动动物物细细胞胞质质粒粒型型载载体体大大多多数数是是通通过过细细菌菌质质粒粒而而获获得得的的，主主要要是是在在质质粒粒的的基基础础上上插插入入了了一一些些病病毒毒或或其其他他一一些些物物种种及及人人的的基基因因表表达达调控序列。调控序列。A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件: a.启动子启动子 b.增强子增强子 c. 多聚腺苷酸化信号多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择标记基药物选择标
6、记基e. 报告基因报告基因 f.表位标签表位标签10页，共48页，星期四。B.B.常用的哺乳动物表达质粒载体常用的哺乳动物表达质粒载体a. pcDNA3.la. pcDNA3.lb. pSIb. pSIc. pCMV-HAc. pCMV-HAd. pBudCE4.1d. pBudCE4.1e. pTREe. pTRE11页，共48页，星期四。（2 2）病毒型载体）病毒型载体 病病毒毒型型载载体体已已被被广广泛泛地地用用于于将将外外源源基基因因导导入入哺哺乳乳动动物物细细胞胞或或替替换换哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中的的缺缺陷陷基基因因，这这类类载载体体将将来来在在基基因因治治疗疗中中将将具具有有
7、非非常常重重要要的的价价值值。目目前前应应用用的的病病毒毒类类型型包包括括：逆逆转转录录病病毒毒、腺腺病病毒毒、牛牛痘痘病毒和杆状病毒等。病毒和杆状病毒等。 A A逆转录病毒载体逆转录病毒载体 逆逆转转录录病病毒毒的的优优点点是是，可可以以使使外外源源基基因因整整合合到到基基因因组组中中，因因而而可可以以被被稳稳定定传传代代和和表表达达。但但是是，由由于于逆逆转转录录病病毒毒的的插插入入位位点点是是随随机机的的，因因而而在在基基因因组组内内的的整整合合有有可可能能破破坏坏一一些些内内源源基基因因的的结结构构，尤尤其其是是当当插插人人到到一一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。些重要的基因位点时
8、会导致细胞的异常。12页，共48页，星期四。B.腺病毒载体腺病毒载体 易于培养、纯化，在感染过程中复制与转录依赖于易于培养、纯化，在感染过程中复制与转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外源基因片段，且宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发生整合，是研究真核基因的良好模腺病毒基因不会发生整合，是研究真核基因的良好模型。型。13页，共48页，星期四。3.DNA片断的重组连接片断的重组连接粘端连接方法要点粘端连接方法要点平端连接方法要点平端连接方法要点单单酶酶单单切切点点 防防自自身身环环化化，希希望望定向插入；定向插入；双双酶酶双双切切点点 定定向向克克隆隆，构构建建表
9、表达载体的最好用此法；达载体的最好用此法；利用同裂解酶产生相同粘端。利用同裂解酶产生相同粘端。平端，平端连接；平端，平端连接；Linker连接酶切产生粘端连接；连接酶切产生粘端连接；Adaptor衔接目的基因和载体；衔接目的基因和载体；同源同聚尾同源同聚尾，克隆，克隆cDNA的最好方法的最好方法T载体，载体，PCR产物产物T/A克隆法连接。克隆法连接。14页，共48页，星期四。4. DNA重组体的鉴定重组体的鉴定 外外源源DNA片片断断是是否否插插入入载载体体构构成成重重组组DNA分分子子，而而插插入入片片断断大大小小，是是否否突突变变及及插插入入位位置置，顺顺序序及及方方向向则则关关系系到到
10、构构建建载载体体是是否否扩扩增增，我我们们所所需需要要的的基基因因或或表表达达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体重组体（1） 酶切鉴定是必需的，基于下述酶切鉴定是必需的，基于下述: A. 限限制制性性图图谱谱个个体体特特异异性性，不不同同的的载载体体或或DNA分分子子物物理理图图谱谱不不同同，酶酶切切后后片片段段大大小小不一样，电泳图谱不一样。不一样，电泳图谱不一样。 B. 同同一一载载体体连连接接不不同同的的DNA片片断断，不不同同的的载载体体连连接接同同一一片片段段(片片段段上上也也有有位位点点）酶切图谱是不同的酶切图谱是不同的 。 C. 插
11、入法插入法(单酶单切点单酶单切点)或替代法或替代法(双酶双位点双酶双位点)酶切，一般来说用酶切，一般来说用3种限制酶切：种限制酶切： 可可鉴鉴定定载载体体及及 插插入入片片段段的的大大小小, ,方方向向, ,切切后后并并电电泳泳分分析析, ,以以确确定定是是否否得得到到预预期期的的rDNArDNA。15页，共48页，星期四。（2）若构建）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行在序列测定。重组体是为了克隆某个基因，可进行在序列测定。（3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。16页，共48页，星期四。 对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞
12、的正对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞的正常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子。根常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子。根据转染的机制不同可将转染法分为：据转染的机制不同可将转染法分为： 1.1.化学转染法化学转染法 2.2.物理转染法物理转染法 3.3.病毒感染法病毒感染法 (二二)基因转染真核细胞的基本方法基因转染真核细胞的基本方法17页，共48页，星期四。1.1.化学转染法化学转染法 化化学学转转染染法法包包括括DEAEDEAE一一葡葡聚聚糖糖法法、磷磷酸酸钙钙法法和和人人工工脂脂质体法等。质体法等。目前应用最广泛的是人工质体法。
13、目前应用最广泛的是人工质体法。 1.DEAE-1.DEAE-葡聚糖葡聚糖 是是最最早早应应用用哺哺乳乳动动物物细细胞胞转转染染的的试试剂剂之之一一。DEAE-DEAE-葡葡聚聚糖糖是是阳阳离离子子多多聚聚体体, ,它它与与带带负负电电的的核核酸酸结结合合后后接接近近细细胞胞膜膜而而被被摄摄取取。DEAEDEAE一一葡葡聚聚糖糖转转染染已已成成功功地地应应用用于于瞬瞬时时开开始始，但用于稳定转染却不可靠。但用于稳定转染却不可靠。18页，共48页，星期四。2. 2. 磷酸钙共沉淀转染法磷酸钙共沉淀转染法 由由于于试试剂剂易易得得、价价格格便便宜宜而而被被广广泛泛用用于于瞬瞬时时转转染染和和稳稳定定
14、染染的的研研究究。方方法法是是，先先将将DNADNA和和氯氯化化钙钙混混合合，然然后后加加人人到到PBSPBS中中慢慢慢慢形形成成DNADNA磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀，后后把把含含有有沉沉淀淀的的混混悬悬液液加加到到培培养养的的细细胞胞上上，通通过过胞胞膜膜的的内内吞吞作作用摄人用摄人DNADNA。3. 3. 人工脂质体法人工脂质体法 脂脂质质体体还还可可以以介介导导DNADNA和和RNARNA转转动动物物和和人人的的体体内内，用用于于基基因因治治疗疗。人人工工合合成成的的阳阳离离子子脂脂质质体体与与带带负负电电荷荷的的核核酸酸结结合合后后形形成成合合物物，当当复复合合物物接接近近细细胞胞膜膜时时
15、被被内内吞吞成成为为内内体体进进入入细细胞胞质质，随随后后DNADNA复复合合物物被被释释放放进进入入细胞核内。细胞核内。19页，共48页，星期四。2.2.物理方法物理方法 包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。（1 1）电穿孔法）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲需要较多的细胞。影响转染
16、效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。又不杀死细胞的最佳平衡点。 20页，共48页，星期四。（2 2）显微注射法）显微注射法 该该法法虽虽然然费费力力，但但却却是是非非常常有有效效的的将将核核酸酸导导人人细细胞胞或或细细胞胞核核的的方方法法。这这种种方方法法常常用用来来制制备备转转基基因因动动物物，但但不不适适用用于于需需要要大量转染细胞的研究。大量转染细胞的研究。（3 3）基因枪法）基因枪法 该该法法依依靠靠携携带带了了核核酸酸的的高高速速粒粒子子而而将将核核酸酸导导人人细细胞胞内内，这这种种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。方法适用于培养的细胞和在体的细胞。 21页，共48页，星期四。3.病毒感染法病毒感染法 病病毒毒颗颗粒粒是是一一类类十十分分有有效效的的基基因因释释放放系系统统，因因此此，它它是是将将外外源源基基因因导导人人大大量量细细胞胞最最有有效效的的方方法法。病病毒毒感感染染具具有有高高效效率率、可可稳稳定定遗遗传传、适适用用于于各各种种不不同同来来源源的的细细胞胞及及操操作作
