《浅论人RORγtmRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浅论人RORγtmRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浅论人RO&tmRNA实时荧光定星PCR佥测方法的建立及初步应用【摘要】目的：建立检测人RO&t(retinoidrelatedorphanreceptorgammat)mRNA的SYBRGreenl实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qRTPCR)方法。方法：根据人ROWtmRNA勺保守序列设计特异性引物，提取经PMARJ离子霉素刺激的人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC总RNA并逆转录成cDNA与pMD18T载体连接构建质粒标准品。采用qRTPCR方法检测RORtmRNA水平，并评
2、价该方法的线性、特异性及重复性。应用该方法检测Graves病(Gravesdisease,GD)患者外周血中RO&tmRNA的相对表达。结果：该方法标准曲线的相关系数为，融解曲线分析显示单个峰，pMD18TROryt质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为嘛口%初步研究表明GD患者组RO&tmRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(t=-,)。结论：建立的检测人RORtmRNA的SYBRGreenI实时荧光定量PCRPa法灵敏、特异且重复性好，为临床应用提供了实验基础。【关键词】RORyt;实时定量PCR;SYBRGreenIAbstractObjective:Toestablisha
3、SYBRGreenIrealtimefluorescentquantitativePCR(qRTPCR)methodforthedetectionofhumanRO&t(retinoidrelatedorphanreceptorgammat):ThespecificprimersweredesignedaccordingtotheconservedsequenceofhumanRORytRNAwasextractedfromhumanperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)stimulatedbyPMAandionomycin,andwastranscribe
4、dreverselyintoRO&tgenewasobtainedbyPCRandclonedintoPMD18vectorbyTAclonelinearity,specificityandrepeatabilityofthemethodwererelativeexpressionlevelofhumanRORytmRNAinPBMCsfrompatientswithGDwasdetectedbythismethod.Results:Thecoefficientofcorrelationofthestandardcurveofthismethodwas,meltingcurvewassingl
5、epeak,andtheCVsinintraandinterassaywere%,%and%inhighandlowcopiesplasmidstandardsrelativeexpressionlevelofhumanRORtmRNAinGDgroupwashighermarkedlythanthatinhealthycontrolgroup(t=-,).Conclusion:qRTPCRwasasensitive,specificandrepeatablemethodforthedetectionofhumanRORtmRNA,andthismethodservesasatechnolog
6、icbaseforclinicalapplication.Keywordsretinoidrelatedorphanreceptorgammat;realtimequantitativePCR;SYBRGreenIRORrt(retinoidrelatedorphanreceptorgammat)基因是RORC勺一种剪接变异体，最初因主要表达在CD4+CD8胸腺细胞而得名1。近期研究表明Th17细胞在炎症反应及自身免疫病等疾病中发挥了重要作用，RORt作为Th17细胞特异性转录因子可诱导IL17A,IL17F等因子的表达。本文建立了一种检测人rort基因的实时荧光定量PCR（realtimef
7、luorescencequantitativePCR,qRTPCR）方法，并初步应用于Graves病患者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC中RORrtmRNA的检测，为研究Th17细胞的分化和功能提供实验手段。1材料和方法材料研究对象GD患者组22例，男5例，女17例，平均年龄（土）岁，均为在江苏大学附属人民医院就诊的经临床症状和实验室检查符合G眼断标准的初诊患者。健康对照组18例，男5例，女13例，平均年龄（土）岁，无其他急慢性疾病。主要试剂和仪器Ficoll淋巴细胞分离液（天津濒洋生物技术有限公司），RPMI1640培养基（美国Gibc
8、o公司）,小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），PMAIonomycin（Sigma公司）,Trizol（Invitrogen公司），逆转录试剂盒（ToYoBo有限公司），rTaq酶、dNTP10X缓冲液，pMD18T,EcoRI,SalI（TakaRa公司）,SYBRGreenIRealTimePCRKit（杭州BIOER公司），RotorGeneRG6000荧光定量PCRZ（澳大利亚Corbett公司），pMD18T3肌动蛋白质粒由本实验室构建并保存。方法引物设计及合成利用PremerPremier软件根据NCBI基因库中RORtmRNA保守序列设计PCR引物，并由上海生工生物工程技术服
9、务有限公司合成，其中RO&t:上游5CCTGGGCTCCTCGCCTGACC3;下游5TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC3;扩增片段169bp。3肌动蛋白：上游5CACGAAACTACCTTCAACTCC3；下游5CATACTCCTGCTTGCTGATC3；扩增片段262bp样本处理取外周静脉血5ml经肝素抗凝后，利用淋巴细胞分离液分离PBMC然后用RPMI1640培养基(含终浓度为50ng/mlPM得口终浓度为1(1g/ml离子霉素)调整细胞密度为1x106/ml,取1ml放入24孔板，于5%CO237C刺激培养，5h后收集细胞，向其中加入1mlTrizol试剂裂解细胞，提取总RN
10、A用逆转录试剂盒以Oligo(dT)20将总RN秘转成cDNA反应条件为：42C,20min;99C,5min;4C,5min。合成的cDNA于-80C冰箱保存备用。pMD18TRORyt重组质粒的构建以上述制备的cDNA模板，利用PCFT增RORt片段。反应条件：94C预变性5min;94C,30s;65C,30s;72C,30s;35个循环;72C,7min。将PC荫物与pMD18T载体进行TA克隆，经EcoRI酶切，EcoRI和Sall双酶切及PC嗜定，阳性克隆送上海英骏公司测序，证实与NCBI基因库中RORt基因序列完全一致。阳性克隆菌株通过LB培养基扩增，抽提并纯化质粒，将纯化质粒稀
11、释成(103108)copies/pl作为标准品于-20C冰箱保存备用标准曲线的制备以稀释的标准品作为模板在荧光定量PCR义上进行扩增，制备标准曲线。为避免引物二聚体的干扰，扩增时采用四步法，即：94C预变性5min;94C,30s;65C（ROR丫t）/56C（&肌动蛋白）30s;72C,30s;87C（ROR丫t）/86C（&肌动蛋白）8s;扩增35（RORyt）/30（3肌动蛋白）个循环。扩增结束后由仪器内置软件绘制标准曲线和融解曲线。特异性的评价将标准品及部分临床标本cDNA的PCF物进行琼脂糖凝胶电泳，分析该方法的特异性。重复性的分析以pMD18TROR丫t质粒标准品相对低拷贝数（1
12、04copies/I）和相对高拷贝数（107copies/卜I）在批内和批间均重复检测10次作为重复性实验，获取各自的变异系数。样本RO&tmRNA相对表达量的检测将样本cDNA标准品、空白对照、阴性对照及RNA寸照按照上述反应体系和反应条件同时进行扩增，根据标准曲线分别检测每个样本的RO&t和0肌动蛋白mRNAcopies/（11,最后，以0肌动蛋白为参照校准RO&t的相对表达。统计学分析利用软件进行统计分析。各组数据以均数土标准差（土s）表示，组间比较采用两样本t检验。以为有统计学意义。2结果qRTPCR检测人RORtmRN街法学的建立pMD18TROR丫t重组质粒的鉴定pMD18TROR
13、丫tTA克隆质粒经EcoRI和SalI双酶切，可见2653bp大片段和208bp小片段，同时经PCFT增出169bp的片段（图1）。后经测序鉴定与RO&t基因序列完全一致，从而证实PMD18TRORTt阳性质粒构建成功。M1:TakaRa250bp标准参照物；1:pMD18TRORytEcoRI酶切;2:pMD18TRORytEcoRI和SalI酶切;3:pMD18TRORyt质粒PCRT物；M2TakaRaDL2000DNA标准参照物qRTPCR检测rortmRNA勺标准曲线和融解曲线将上述构建成功的pMD18TROR丫t阳性质粒稀释成（103108）copies/卜l作为模板制备标准曲线和
14、融解曲线。其中，标准曲线如图2a所示，相关系数（R2）为；斜率（M）为-。融解曲线如图2b所示，只有单个融解曲线峰。qRTPCR检测RORtmRN肉法的特异性为了检验该方法的特异性，我们将制备标准曲线的质粒标准品和部分临床标本cDNA的PORT物进行琼脂糖凝胶电泳。从图3中可以看出只有RORrt目的基因条带而无其他任何条带。qRTPCR检测rortmRNA&法的重复性pMD18TRORTt质粒标准品相对低拷贝数（104copies/（11）批内和批间变异系数分别为嘛口;pMD18TROR丫t质粒标准品相对高拷贝数（107copies/（11）批内和批间变异系数分别为嘛口%GD患者外周血RORt
15、mRNA目对表达水平的检测RORtmRNA的相对表达水平以RORt/3肌动蛋白mRN此匕值表示。GD患者组和健康对照的比值分别为土和土，两者比较，差异有统计学意义（t=-,）。3讨论RONt是核激素受体家族成员之一，目前，尽管其配体未知，但相关的研究业已表明它是Th17细胞特异性转录因子，主要诱导IL17的表达。由于IL17受体分布广泛，故而IL17能作用于许多类型细胞（如内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等），诱导众多的细胞因子（如IL6、TNFa、粒单细胞集落刺激因子、粒细胞刺激因子等）和趋化因子（如IL8、cxaa化因子配体1、CC趋化因子配体20等）的表达4-5。这些细胞因子、趋
16、化因子活化诱导中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，使之浸润到炎症部位，一方面消除胞外细菌和真菌，保护机体避免炎症损伤，如发现IL17受体缺陷的小鼠更容易遭受肺部细菌感染，其原因与中性粒细胞浸润到肺部的数量减少有关；另一方面这些细胞可能导致慢性炎症和自身免疫性疾病，如在类风湿性关节炎患者关节滑膜液中的IL17通过刺激滑膜细胞表达肝细胞生长因子等血管因子，促进血管翳的生成，破坏关节组织。G院一种器官特异性自身免疫性疾病，其具体的致病机制还未阐明，近年细胞因子在GD发病中的作用受到重视。有研究表明在GD患者未治疗时，血清中IL6表达明显增加，经治疗缓解后，IL6下降至正常水平，且IL6水平与甲状腺激素明显相关；TNFa与其受体参与GD中甲状腺功能损坏的细胞毒性过程。本研究中，我们发现明显高于健康对照组()，这提示GD患者体内可能存在着Th17细胞的极化及IL17,IL6,TNF等细胞因子表达增强的现象,Graves病患者外
