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1、浅论Livin基因在非小细胞肺癌中表达的分子生物学特性【关键词】Livin基因；非小细胞肺癌分子生物学原癌基因和抑癌基因所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜。通过对原癌和抑癌基因蛋白结构和功能的分析，发现许多原癌基因和抑癌基因位于信号通路中的不同部位，参与许多重要的细胞活动过程，如细胞生长和分化、DNAM制和损伤修复、基因转录和表达、细胞周期调控等，在细胞凋亡、衰老过程中起重要作用，也在肿瘤的发生发展和转移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子(inhibitorofapoptosisprotein,IAP)家族的新成员之一，具有抗细胞
2、凋亡作用，并明显地在肿瘤组织中特异性表达。目前的研究表明，Livin基因在各系统的正常组织中很少表达，但在胚胎组织或发育组织、淋巴细胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种组织中广泛表达。非小细胞肺癌的肿瘤细胞系中也有Livin基因的表达，但其与肿瘤的发生、转移、耐药性等之间的确切关系尚不清楚。Livin基因特异性地表达于肿瘤组织，有可能成为NSCLC期诊断的分子标志物，并为基因治疗提供新靶点:1-3。本文就Livin基因在NSCLCh的表达及其抗细胞凋亡作用、信号传导途径与调节机制等分子生物学特性作一综述。1 Livin基因及蛋白结构功能的多样性IAP是一类重要的抗细胞凋亡因子，其共
3、同的结构特征是N端含有一个或多个(最多为3个)串联的杆状病毒IAP重复序列结构域(baculovirusIAPrepeatsdomain,BIRs)和C端含有一个环指结构域(RINGfingerdomain,RING)。目前已发现人类IAP家族有8个成员，即NIAP,XIAP(ILP1/MIHA),cIAP1(HIAP2/MIHB),cIAP2(HIAP1/MIHC),survivin(TIAP),apollon(Bruce),ILP2(TsIAP)和1ivin(MLIAP/KIAP)2Livin蛋白是IAP家族的一个新成员，一些实验室采用IAP同源序列（BIR或RING）寻找的方法，分别从人
4、类基因组cDNA文库中克隆得到Livin核昔酸序列，从不同的组织中发现了Livin基因的表达。Kasof等3在发育组织和肿瘤组织中发现并命名了Livin基因。Lin等4从人胎肾cDNA文库中分离到该基因，故称其为KIAP。Vucic等5发现Livin基因在G361和SKMel29两种黑色素瘤细胞源株中高表达，将其命名为MLIAP。Ashhab等6发现了该基因存在2个剪接变异体，分别命名为Livina和Livin6。同时，Lin等4用荧光原位杂交方法确定Livin基因位于人20号染色体区域，全长kb，包含7个外显子。此外还发现存在长约，和kb的转录子，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，包含
5、4个a螺旋和一个三股抗平行3片层，与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。C端含有一个RING环指结构:4,6,氨基酸残基C124,C127,H44及C151与锌原子结合，借以稳定整个重叠结构。2 Livin蛋白有a和&两种变异体，分别由298和280个氨基酸组成，二者相差18个氨基酸，此区域由介于BIR和RING结构之间的第6外显子5端54bp的基因序列编码。Livin蛋白主要表达于胞质，但Kasof等3认为livin蛋白的细胞内分布与Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞质内呈丝状表达，同时也表达于胞核，并认为livin蛋白C末端的RING结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。
6、Livin基因mRN3端非翻译区多腺昔酸化与存在未剪接加工成熟的前体RN诵关，不同的剪辑有不同的变异体及亚型，这种结构基础有可能解释Livin基因蛋白存在多个结构功能。如BIR结构域内单个氨基酸的突变就能发挥其抗凋亡作用，作者的实验也发现在A549细胞中表达的Livin蛋白缺少66个核昔酸的变异体，其确切的功能意义尚不清楚。但Livin基因蛋白结构的变化与其功能的多样性存在明显的相关性Livin基因在NSCLCH勺表达Livin基因仅在少数正常组织中表达，各家报道的研究结果存在较大差异，目前还不能确定Livin基因在人正常组织中的表达谱及其生理意义2,7。Tanabe等7采用RTPCR法对15
7、例正常肺组织和38例NSCL短织作对比研究，发现LivinmRN雁NSCL短织阳性率为%正常肺组织阳性率为显示Livin基因在NSCLC3呈高表达，同时证明Livin基因与Survivin基因在NSCLC3的表达并不相关。CrnkovicMertens等1,8同时采用NSCL短织和NSCLCCHeLa细胞株培养检测Livin基因及其两种异构体Livina和Livin3的表达，结果显示Livina和Livin3在NSCL甘呈高表达。采用RNAi技术分别使异构体基因沉默，发现Livin3和Livina基因的功能意义不完全相同，Livin3在细胞凋亡中起关键作用。国内崔肃等:9：采用RTPCR法检测
8、NSCLC&织中LivinamRN/AlLivin&mRNA勺表达，并用Westernblot方法分析Livin蛋白的表达，结果显示45例NSCLC织中LivinmRN戚达阳性率为,两种异构体基本同时表达，Livin3mRNA勺表达量略高于LivinamRNA而在癌旁正常肺组织和肺良性瘤样病变组织呈低表达，阳性率分别为和。而且LivinmRNA表达阳性标本中均能检测到Livin蛋白表达。陈淼等10采用免疫组织化学(SABC)的方法检测Livin蛋白在40例NSCLC织以及12例正常和肺良性疾病组织中的表达，结果显不22例腺癌和18例鳞癌组织中的Livin蛋白阳性率分别为和%,而正常肺组织和肺良
9、性疾病组织均未检出Livin蛋白表达。他们同时观察到不同分化程度NSCL短织之间Livin蛋白的表达无显着性差异。有和无淋巴结转移的肺癌组织中Livin蛋白表达的阳性率分别为和,两组的显着性差异标志着不同的生物学特性。孙建国等11的研究结果显示，48例NSCL禽织中LivinmRN染达阳性率为其表达与NSCLCa织学类型相关，腺癌中LivinmRNA表达阳性率达明显高于鳞癌和大细胞癌，而癌旁组织和肺良性疾病组织均未检出阳性结果，而且Livin蛋白表达与mRNAE达相一致。研究还发现放、化疗后NSCL短织中的Livin表达的阳性率为显着高于未放、化疗组织，提示放、化疗可明显诱导Livin蛋白的表
10、达，这可能与临床上NSCLC寸化疗药物和放疗耐受有关。目前，Livin基因在NSCLC&织中特异性地高表达的现象已引起许多学者的关注12，但LivinmRNA的表达与NSCLC&者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期等的相关关系尚未完全阐明，Livin基因作为NSCLC勺分子标志物，成为诊断和治疗nscl(Ct靶点的可能性已引起人们的极大兴趣。Livin抗细胞凋亡作用及其调节机制Kasof等3,8研究显示，Livin蛋白N端的短基与Caspase3,7,9的直接结合，阻断了caspase发挥凋亡作用的途径，从而抑制了细胞凋亡的发生。将Livin基因转染HeLa细胞，受转染细胞内由F
11、ADD,Bax,RIP,RIP3及DR6诱导的细胞凋亡可被有效阻断。Vucic等:13将Livin基因转染乳腺癌MCFTffl胞，证实转染细胞对Fas,TNFR1,DR4及dr断导的细胞凋亡具有显着的抑制作用。许多化疗药物可导致肿瘤细胞DNA勺损伤而诱导细胞凋亡，转染Livin基因的MCFZ田胞可有效对抗阿霉素以及4TBP诱导的细胞凋亡。但是各家报道Livina和Livinp蛋白的抗细胞凋亡作用存在一定差异。Yang等14,15观察在JurkatT淋巴细胞株中，Livin基因可明显抑制由TNFa及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡，其抗细胞凋亡作用强于Bcl2。Livina对STS诱导的Jurkat
12、细胞凋亡表现出一定的抑制作用，而Livin3则无此作用。CrnkovicMertens等8采用rnaf扰技术分别使内源性Livina和Livin3基因沉默，检测两者的抗凋亡作用，结果显示Livin3可显着抑制依托泊昔和紫外线放射治疗等诱导的HeLa细胞凋亡，但Livina则不明显。更多的研究则认为Livina和Livin3基因均具有抗细胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途径有待进一步证实。许多研究证实:12-16,Livin蛋白介导细胞凋亡抑制存在不同的调节途径，通过与激活形式的Caspase3和Caspase7结合，抑制其活性。Livin蛋白还可与未加工的或断裂形式的Caspase9结合，可
13、抑制由Apaf1、细胞色素C及dATP诱导的Caspase9激活作用。Livin蛋白与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livin蛋白与Caspase的结合作用的减弱或消失，致使Livin蛋白抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失，这也许可成为基因治疗的调节点。Sanna等12的研究显示，Livin可激活MA哦酶JNK1和JNK2,但对JNK3无激活作用，而Livin蛋白对JNK1的激活作用远远强于JNK2,并且这是Livin蛋白对抗TNFa和ICE介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK激活，但Livin
14、蛋白对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK蓿号途径，而是通过TAB1/TAK1途径实现。TAK1是MAP3敖酶之一，在TGF61的刺激下TAK1可激活JNK1。TAB1是TAK1的共活化因子，TAB1本身对于JNK1无激活作用，但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。Livin蛋白可与TAB1结合，并进一步激活TAK1。此外，Vucic等:13证实SMA殷活性肽片段可与Livin蛋白的BIR结构域特异性结合，抑制Livin蛋白与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由SMAS导的对Livin蛋白抗细胞凋亡作用的负性调节机制。3 Livin基因治疗NSCLC勺临床应用前景鉴于Li
15、vin基因具有明显的抗细胞凋亡作用以及在肿瘤组织中的特异性表达，人们注意到其与肿瘤发生发展的关系，并开始探讨Livin用于肿瘤基因治疗的可行性。应用基因转染技术可获得稳定表达Livina和Livin3的NSCLCA54毯田胞克隆。孙建国等17用平板克隆形成实验研究A549细胞生长情况，用MTT法检测其对放、化疗的敏感性，用细胞周期分析法观察细胞凋亡情况。结果发现转染Livina和Livinp基因后的细胞尤其是表达Livina的A549细胞，克隆形成能力提高、倍增时间缩短，对多种化疗药物和放射线敏感性降低，10Gy放射线照射下仅有咏田胞发生凋亡。可见Livin基因参与NSCLC勺发生发展，也可能
16、是NSCLG田胞对放、化疗耐受的重要机制之一。CrnkovicMertens等:18利用基因转染和特异性小干扰RNA(siRNA成术，在肺癌SPCA1细胞株中建立Livin异构体a和3特异的基因沉默体系，观察诱导SPCA1细胞凋亡效应中的不同作用，并用TUNEL和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示内源性Livina和Livin3基因沉默后，SPCAl细胞克隆形成能力较对照组显着下降，促使SPCA1细胞发生凋亡，表明Livina和Livin3两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点，通过使Livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。由于Livin基因仅在肿瘤组织表达而在正常组织极少表达，Yagihashi等19用ELISA法在肺癌患者外周血和肿瘤组织中均检测到自身Livin蛋白抗体，其组织特异性显而易见。Hariu等20用Livin反义核昔酸片段刺激周围
