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1、放射免疫荧光标记免疫详解演示放射免疫荧光标记免疫详解演示文稿文稿1页，共42页，星期一。优选放射免疫荧光标记免疫优选放射免疫荧光标记免疫2页，共42页，星期一。免疫免疫标记标记技术技术=抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏度灵敏度特异性特异性免疫标记技术的主要特点：免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏度高特异性、高灵敏度免疫技术免疫技术+ +标记技术标记技术3页，共42页，星期一。检测方法检测方法 检测范围检测范围生化、常规免疫生化、常规免疫 mgg（10-3 10-6 g）荧光免疫、酶免疫荧光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫放射免疫、发光免疫、发光免疫
2、ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）4页，共42页，星期一。标记技术：标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。接。免疫技术：免疫技术：以抗原以抗原- -抗体反应原理为基础，对样品中相应抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。抗原或抗体进行检测。标记免疫分析标记免疫分析：是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建立的测定技术体系。其核心即是高灵敏性和高度特异性的有机结立的测定技术体系。其核心即是高灵敏性和高度特异性的有机结合。合。5页，共42页，星期一
3、。常见免疫标记技术常见免疫标记技术放射免疫技术放射免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术酶免疫技术 6页，共42页，星期一。放射免疫技术放射免疫技术7页，共42页，星期一。19591959年，年，美国，美国，YalowYalow和和BersonBerson测定血清胰岛素含量（标记抗原）测定血清胰岛素含量（标记抗原）19771977年获诺贝尔医学奖年获诺贝尔医学奖 优点：特异性强，灵敏度高，结果准优点：特异性强，灵敏度高，结果准确，检样用量少，结果重复性好，操确，检样用量少，结果重复性好，操作易自动化；作易自动化；缺点：对抗体质量要求高，有放射性危害，检测仪器价格较高8页，共42页，星期一。
4、 放射免疫技术分类放射免疫技术分类1.放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA) 以以标记抗原标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。定待检样品中抗原量。2.免疫放射分析免疫放射分析(immunoradiometric assay,IRMA) 以以过量过量标记抗体标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。离游离和结合标记抗体。3.其他：其他： 放射受体分析放射受体分析(radioreceptor assay,RRA) 放射配体
5、结合分析放射配体结合分析 (radioligand binding assay,RBA)9页，共42页，星期一。 Ag Ab *Ag Ag-Ab+标记抗原（标记抗原（F） 特异性抗体特异性抗体 被检抗原被检抗原 非标记抗原抗体复合物非标记抗原抗体复合物标记抗原抗体复合物（标记抗原抗体复合物（B） *Ag-Ablimited, competitive 1.1 1.1 放射免疫分析（放射免疫分析（放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）技术原理）技术原理10页，共42页，星期一。抗原标准品与待测抗原抗原标准品与待测抗原 结构-完全相同/结构相似且亲和力相近 纯度-纯度90%以上（免疫纯） 较高的
6、放射比放射性同位素放射性同位素特异性抗体特异性抗体 特异性高、亲和力高（Ka）、效价高 。“三高三高”！ 1.2 1.2 放射免疫技术基本条件放射免疫技术基本条件放射免疫技术基本条件放射免疫技术基本条件11页，共42页，星期一。标记核素标记核素125I 3H 射线射线 理化性理化性活泼活泼 差差核素丰度核素丰度 90% 半衰期半衰期 60.2d 12.3y标记方法标记方法 简单简单复杂复杂标记设备标记设备 低廉低廉( 计数仪计数仪)昂贵昂贵( 液闪仪液闪仪)测量条件测量条件 简单简单 复杂复杂12页，共42页，星期一。氯胺氯胺-T -T 法法：最常用的最常用的 125125I I 标记法，标记
7、法，125125I I 与酪氨酸共价结方法简与酪氨酸共价结方法简便，但易造成蛋白质的损伤便，但易造成蛋白质的损伤乳过氧化酶法（乳过氧化酶法（LPOLPO）：标记方法更温和，对被标记物的生物：标记方法更温和，对被标记物的生物活性影响活性影响125I - -标记物的制备标记物的制备125I - -标记物的纯化标记物的纯化Sephadex 层析层析，硅胶，硅胶 G 薄板层析，薄板层析， HPLC 分离分离13页，共42页，星期一。125I - -标记物的鉴定标记物的鉴定比放射性：单位化学量标记物中所含的放射性强度单位化学量标记物中所含的放射性强度; ;免疫活性：与过量抗体反应的百分比越大，标记物免疫
8、活性越好14页，共42页，星期一。 游离抗原与免疫复合物的分离第二抗体沉淀法第二抗体沉淀法 PEG 沉淀法沉淀法 PR 试剂法试剂法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分离彻底，迅速分离彻底，迅速分离试剂和过程不分离试剂和过程不影响反应平衡影响反应平衡效果不受反应介质效果不受反应介质影响影响 操作应简单、重复性操作应简单、重复性好好经济经济 15页，共42页，星期一。测量、数据处测量、数据处理理晶体闪烁计数器晶体闪烁计数器 包括了包括了NaINaI闪烁晶闪烁晶体、光电倍增管体、光电倍增管以及计数器以及计数器测量的放射性信测量的放射性信 号是仪器输出的号是仪器输出的 电脉冲数：每分电脉冲数：每分 钟计数
9、钟计数(cpm)(cpm) 计算计算 参数参数cpmcpmB/T B/T (%)(%)F/T (%)F/T (%)B/F B/F (%)(%)B/BB/B0 0 (%)(%)拟合拟合注：注：T T即是即是B B（标记的复合物）（标记的复合物）与与F F（标记抗原）的总和（标记抗原）的总和16页，共42页，星期一。 Ag* Ab Ag 标记抗原标记抗原 特异性抗体特异性抗体 待测抗原待测抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合物抗原抗体复合物分离分离Ag*-Ab 和游离和游离Ag*从标准曲线上读知含量从标准曲线上读知含量 测定测定Ag*-Ab和游离和游离Ag*放射性放射性 放放射射
10、免免疫疫测测定定法法(RIA)示示意意图图17页，共42页，星期一。 1.3 1.3 放射免疫技术基本类型放射免疫技术基本类型液相法 平衡法（一步法） 顺序加样法 固相法18页，共42页，星期一。免疫放射分析技术免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）1968年，Miles 和Hales应用同位素标记胰岛素抗体，成功检测牛血清中的胰岛素。Type IRMARIA被标记物质抗体抗体抗原抗原抗体用量过量过量限量限量被检抗原相对分子量相对较大相对较大相对较小相对较小反应方式分步结合分步结合竞争结合竞争结合B、F分离方法固相洗涤分离固相洗涤分离液相沉淀液相沉淀/ /
11、吸附分离吸附分离19页，共42页，星期一。2.1 2.1 免疫放射技术基本条件免疫放射技术基本条件标记抗体的制备 抗体亲和力要求不高固相抗原免疫吸附剂 对抗原吸附力强，对非特异性蛋白吸附少，结合过程中高度分散 （重氮化纤维素，琼脂糖4B珠）20页，共42页，星期一。2.2 2.2 免疫放射技术基本类型免疫放射技术基本类型 经典IRMA）21页，共42页，星期一。 双抗夹心法2.2 2.2 免疫放射技术基本类型免疫放射技术基本类型22页，共42页，星期一。放放射射免免疫疫分分析析技技术术的的灵灵敏敏度度高高、特特异异性性强强、精精密密度度好好, , 常常用用于于各各种种激激素素、微微量量蛋蛋白白
12、质质、肿肿瘤瘤标标志志物物和和药药物物等等微微量量物物质质的的测测定定。但但由由于于放放射射污污染染和和危危害害，常常用用核核素素半半衰衰期期短短，试试剂剂盒盒稳稳定定期不长等诸多不足期不长等诸多不足, RIA, RIA将逐渐被取代将逐渐被取代。放射免疫分析技术的应用放射免疫分析技术的应用23页，共42页，星期一。荧光免疫技术Immunofluorescence technique， IFA24页，共42页，星期一。1958年，Riggs等合成了异硫氰酸荧光黄（fluorescent isothiocyanate，FITC）；Marshall对荧光标记方法进行了改进，荧光技术逐渐推广1942年
13、，Coons等，异硫氰酸荧光素标记抗体，检测小鼠组织切片中可溶性肺炎链球菌多糖抗原IFA荧光素荧光素敏感可测敏感可测抗原抗体反应抗原抗体反应特异性特异性显微技术显微技术高度精确高度精确优点：优点：特异性强，敏感性高，速度快，结果直观-病原微生物缺点：缺点：荧光标本保存难（淬灭）非特异性染色25页，共42页，星期一。荧光素具有共轭双键体系荧光素具有共轭双键体系的化学结构的化学结构通常处于最低能量状态通常处于最低能量状态-基态基态激发光（紫外光）照射，跃迁激发光（紫外光）照射，跃迁到激发态到激发态回到基态，释放光子能量回到基态，释放光子能量（波长较长的可见光（波长较长的可见光 - -荧光）荧光）
14、荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析（IFAIFAIFAIFA）技术原理技术原理技术原理技术原理26页，共42页，星期一。 荧光免疫分析荧光免疫分析（IFAIFA）技术原理技术原理YYY27页，共42页，星期一。 一种有机或无机化学物质，其接受激发光后，能够以发射光形式产生明亮的荧光而作为染料使用。 各种荧光素都有各自的激发波长和发射波长。因发 射波长不同而颜色不同。 异硫氰酸荧光黄（FITC），四乙基罗丹明（Rb200），藻红蛋白（PE）。 荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析（IFAIFAIFAIFA）基本条件 1. 1. 荧光素荧光素28页，共42页，星期一。较高
15、较稳定的荧光效率具有能与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团与蛋白质结合简单快速结合产物的荧光颜色与实验对象的自发荧光对比鲜明结合物具有一定的耐贮藏性29页，共42页，星期一。抗体：特异性强、效价高、标记后活性高标记前：梅花状双扩测效价标记抗体种类：多克隆抗体、单克隆抗体、葡萄球菌A蛋白（荧光二抗通用试剂） 2. 2. 待标记抗体待标记抗体1mg/mL30页，共42页，星期一。 FITC FITC（ 异硫氰酸荧光黄）标记抗体异硫氰酸荧光黄）标记抗体MarsshallMarsshall法法原理原理 当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个Ig
16、G分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合1520个。 3. 荧光标记抗体制备与纯化荧光标记抗体制备与纯化荧光素荧光素- FITC- NC N - 蛋白质蛋白质 FITC- N C N - 蛋白质蛋白质 S H H H S H 31页，共42页，星期一。操作流程操作流程抗体的准备：抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液） 碳酸盐缓冲液为总量的1/10。荧光素的准备：荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC （抗体与荧光素比例为50-100:1）标记：标记：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4透析：透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4过柱：过柱：葡萄糖凝胶G50或 G25柱分离游离荧光素保存保存 ：4 -40等量甘油分装保存。 3. 荧光标记抗体制备与纯化荧光标记抗体制备与纯化32页，共42页，星期一。 4. 荧光标记抗体鉴定荧光标记抗体鉴定1 1 特异性染色效价测定特异性染色效价测定-与相应抗原标本染色与相应抗原标本染色2 2 非特异性染色测定非特异
