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1、方法学评价试验重复性试验TP演示文稿1页，共29页，星期一。优选方法学评价试验重复性试验TP2页，共29页，星期一。方法学评价试验-重复性试验方法学评价试验重复性试验l掌握：批内精密度评价的基本原理、实验步骤及统掌握：批内精密度评价的基本原理、实验步骤及统计方法。计方法。l熟悉：重复性实验的注意事项和评价标准。熟悉：重复性实验的注意事项和评价标准。l了解：批间、日内及日间重复性实验的区别了解：批间、日内及日间重复性实验的区别3页，共29页，星期一。什么是方法学评价方法学评价（方法学评价（evalutionofmethodology）是）是通过实验的途径客观评价实验方法及其试剂分析性能通过实验的
2、途径客观评价实验方法及其试剂分析性能的重要手段。其基本内容是通过实验途径，测定并评的重要手段。其基本内容是通过实验途径，测定并评价方法的精密度与准确度，在实验中测定的是不精密价方法的精密度与准确度，在实验中测定的是不精密度与不准确度，不论精密度还是准确度，强调的都是度与不准确度，不论精密度还是准确度，强调的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。误差，评价实验的过程就是对误差的测定。方法学评价试验-重复性试验4页，共29页，星期一。方法学评价常用技术性能指标准确度准确度(accuracy)是指测定值与真值之间的符是指测定值与真值之间的符合程度，由于真值实际上也是一个近似值，所以准合程度，由于
3、真值实际上也是一个近似值，所以准确度往往用不准确度来表示。确度往往用不准确度来表示。精密度精密度(precision)是指在重复性条件下对同一是指在重复性条件下对同一标本进行多次测定时，各测定值之间随机误差的大标本进行多次测定时，各测定值之间随机误差的大小。精密度常用标准差小。精密度常用标准差(s)或变异系数或变异系数(CV%)来表来表示。示。方法学评价试验-重复性试验5页，共29页，星期一。方法学评价常用技术性能指标灵敏度灵敏度(sensitivity)是指检测系统可检测出的最是指检测系统可检测出的最低分析物浓度，或称检测限。低分析物浓度，或称检测限。特异度特异度 (specificity，
4、SPE)，又称真阴性率，又称真阴性率(true negative rate，TNR)，即实际无病按该诊断，即实际无病按该诊断标准被正确地判为无病的百分比。它反映筛检试验标准被正确地判为无病的百分比。它反映筛检试验确定非病人的能力。确定非病人的能力。方法学评价试验-重复性试验6页，共29页，星期一。方法学评价常用技术性能指标分析测量范围分析测量范围(analysis measure range，AMR)是指对没是指对没有进行任何预处理（稀释、浓缩等）的标本，分析方法能够有进行任何预处理（稀释、浓缩等）的标本，分析方法能够直接测定出的待测物的范围，也就是系统最终的输出值（活直接测定出的待测物的范围
5、，也就是系统最终的输出值（活性或浓度）与被分析物的活性或浓度成线性比例的范围，即性或浓度）与被分析物的活性或浓度成线性比例的范围，即线性范围。线性范围。临床可报告范围临床可报告范围 (clinical reportable range，CRR)，是，是允许应用样本稀释、浓缩和预处理后，分析方法可测定样本允许应用样本稀释、浓缩和预处理后，分析方法可测定样本中分析物的可靠范围浓度。中分析物的可靠范围浓度。CRR是扩展的是扩展的AMR。方法学评价试验-重复性试验7页，共29页，星期一。重复性试验重复性试验是在相同条件下，用同一方法、同一试剂重复性试验是在相同条件下，用同一方法、同一试剂和校准品、同一
6、台仪器、在同一实验室由同一人操作对和校准品、同一台仪器、在同一实验室由同一人操作对同一标本在尽可能短的时间内进行多次分析测定（一般同一标本在尽可能短的时间内进行多次分析测定（一般为为20次），以获得批内精密度实验数据。其结果反映各次），以获得批内精密度实验数据。其结果反映各次测定结果间相互接近的程度。其目的在于评价或验证次测定结果间相互接近的程度。其目的在于评价或验证试验方法的随机误差或不精密度。试验方法的随机误差或不精密度。 包括批内重复性试验、包括批内重复性试验、日内重复性试验和日间重复性试验等。日内重复性试验和日间重复性试验等。方法学评价试验-重复性试验8页，共29页，星期一。批内重复性
7、试验是将同一材料分成数份实验标本，批内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本，在尽可能短的时间内平行测定在尽可能短的时间内平行测定20次；次；日内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本，日内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本，在在1天内作天内作5轮，每轮轮，每轮4次测定，获得次测定，获得20个测定数据；个测定数据；日间重复性试验是将同一材料分成日间重复性试验是将同一材料分成20份实验标本，份实验标本，每天测定每天测定1份，连测份，连测20天。天。分别作统计处理即可测得候选方法的批内、日内和分别作统计处理即可测得候选方法的批内、日内和日间的随机误差。日间的随机误差。方法学评价试验-重复性试验
8、9页，共29页，星期一。血清(浆)总蛋白(TP)测定血清总蛋白质检测有何临床意义？血清总蛋白质（血清总蛋白质（ total protein total protein ，TPTP）是血清中各种蛋白质的总称，是血浆）是血清中各种蛋白质的总称，是血浆固体成分中含量最多的一类物质，具有维持血液正常胶体渗透压和固体成分中含量最多的一类物质，具有维持血液正常胶体渗透压和pHpH、运输、运输多种代谢物、免疫、催化、营养作用等多种功能。多种代谢物、免疫、催化、营养作用等多种功能。 90%90%以上的血清总蛋白由肝以上的血清总蛋白由肝脏合成，如清蛋白、脏合成，如清蛋白、a a1 1、a a2 2、球蛋白，纤维
9、蛋白原等，当肝脏发生病变时，肝细球蛋白，纤维蛋白原等，当肝脏发生病变时，肝细胞合成蛋白质的功能减退，血浆中蛋白质即会发生质和量的变化。临床上用各种胞合成蛋白质的功能减退，血浆中蛋白质即会发生质和量的变化。临床上用各种方法检测血浆蛋白的含量来方法检测血浆蛋白的含量来协助诊断肝脏疾患，并作为疗效观察，预后判断的指标。协助诊断肝脏疾患，并作为疗效观察，预后判断的指标。但由于肝功能有很大代偿能力及清蛋白半衰期较长，因此肝脏病变往往达到但由于肝功能有很大代偿能力及清蛋白半衰期较长，因此肝脏病变往往达到一定程度和一定病程后才能出现血清总蛋白和清蛋白量的改变。一定程度和一定病程后才能出现血清总蛋白和清蛋白量
10、的改变。10页，共29页，星期一。血清(浆)总蛋白(TP)测定血清总蛋白质检测有何临床意义？1 1生理性升高：剧烈运动后。生理性升高：剧烈运动后。2 2生理性降低：妊娠。生理性降低：妊娠。3 3病理性升高病理性升高（相对少见）：（相对少见）：(1) (1) 血清中水分减少，使总蛋白浓度相对增高。常见于急性失水引起血液浓缩血清中水分减少，使总蛋白浓度相对增高。常见于急性失水引起血液浓缩( (如如呕吐、腹泻等呕吐、腹泻等) )；休克时，毛细血管通透性发生变化，血浆浓缩；慢性肾上腺皮质机能；休克时，毛细血管通透性发生变化，血浆浓缩；慢性肾上腺皮质机能减退的病人，由于钠的丢失继发水分丢失，血浆也发生浓
11、缩。减退的病人，由于钠的丢失继发水分丢失，血浆也发生浓缩。(2) (2) 血清蛋白质合成增加血清蛋白质合成增加( (主要是球蛋白的增加主要是球蛋白的增加) )。总蛋白可超过。总蛋白可超过100g100gL L，多见于多发性骨髓瘤病人。多见于多发性骨髓瘤病人。 参考区间：参考区间：6565 85g/L85g/L11页，共29页，星期一。血清(浆)总蛋白(TP)测定血清总蛋白质检测有何临床意义？4 4病理性降低：病理性降低：(1) (1) 血浆中水分增加，血浆被稀释。因各种原因引起的水钠潴留或输注过多的低血浆中水分增加，血浆被稀释。因各种原因引起的水钠潴留或输注过多的低渗溶液。渗溶液。(2) (2
12、) 营养不良或长期消耗性疾病。如严重结核病和恶性肿瘤等。营养不良或长期消耗性疾病。如严重结核病和恶性肿瘤等。(3) (3) 合成障碍。主要是肝脏功能严重损害时，蛋白质的合成减少，以白蛋白的下合成障碍。主要是肝脏功能严重损害时，蛋白质的合成减少，以白蛋白的下降最为显著。降最为显著。(4) (4) 蛋白质丢失。大出血时大量血液丢失；肾病时尿液中长期丢失蛋白质；严重蛋白质丢失。大出血时大量血液丢失；肾病时尿液中长期丢失蛋白质；严重烧伤时，大量血浆渗出等。烧伤时，大量血浆渗出等。 12页，共29页，星期一。l重复的肽链结构重复的肽链结构l酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外吸收酪氨酸和色氨酸残基对酚试
13、剂反应或紫外吸收l与某些染料特异结合的能力与某些染料特异结合的能力l采用沉淀反应借助浊度或光折射原理测定采用沉淀反应借助浊度或光折射原理测定l电泳的迁移率大小电泳的迁移率大小血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法13页，共29页，星期一。l凯式定氮法（凯式定氮法（N）l双缩脲法（肽键）双缩脲法（肽键）l酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法）l比浊法（沉淀）比浊法（沉淀）血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法早期用于酪氨酸和色氨酸的定量测早期用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。该方法较双缩脲法反应定。该方法较双缩脲法反应灵敏灵敏100倍左右，倍左右，检测范围最低可达检测范围最低可达5g，通常，
14、通常为为20250g，使用，使用很广泛，但花费时间很广泛，但花费时间长（长（4040 6060分钟分钟），干扰因素较多），干扰因素较多( (硫酸硫酸铵；铵；TrisTris缓冲液；甘氨酸，各种硫醇缓冲液；甘氨酸，各种硫醇) )，颜色深浅随不同蛋白质变化颜色深浅随不同蛋白质变化，较适合单，较适合单一蛋白质测定。近年来逐渐被考马斯亮一蛋白质测定。近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。（兰法所取代。（灵敏度好，费时，操作要灵敏度好，费时，操作要严格计时）严格计时）1883年年建立，是经典的蛋白质测定方法。建立，是经典的蛋白质测定方法。该法结果准确，精密度高，该法结果准确，精密度高，灵敏度低，适灵敏度低，适
15、用于用于0.2 1.0mg氮氮测定测定，是蛋白质测定的是蛋白质测定的参考方法参考方法，但由于操作复杂、费时，但由于操作复杂、费时（8 8 10h10h），影响因素较，影响因素较少（主要为非少（主要为非蛋白氮，但可用三氯乙酸沉淀蛋白蛋白氮，但可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）质而分离），不适用于，不适用于常规测定常规测定，目，目前多用于蛋白质的定值和校正其他方前多用于蛋白质的定值和校正其他方法。法。（测定准确，干扰少，费时太长）（测定准确，干扰少，费时太长）此法操作此法操作简便、准确、重复性好，干扰物简便、准确、重复性好，干扰物质少质少(硫酸铵；硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸缓冲液；某些氨基酸)
16、，在在10120g/L浓度范围内成良好的线形关系，浓度范围内成良好的线形关系，批内批内CV值值2%。其缺点是灵敏度较低。其缺点是灵敏度较低(1 1 20mg20mg)，不同蛋白质显色相似，但能满足临，不同蛋白质显色相似，但能满足临床要求，是目前临床测定床要求，是目前临床测定蛋白质的一种蛋白质的一种首选首选方法方法。14页，共29页，星期一。l电泳法电泳法l紫外分光光度法紫外分光光度法血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法此法操作简便、快速（此法操作简便、快速（5 5 1010分钟分钟），不），不消耗样品，测定后仍能回收使用，灵敏消耗样品，测定后仍能回收使用，灵敏高，适用于高，适用于50100g测测定。但受蛋白质定。但受蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量的影响，干扰因中酪氨酸和色氨酸含量的影响，干扰因素也较多（各种嘌呤和嘧啶，各种核苷素也较多（各种嘌呤和嘧啶，各种核苷酸，可校正）。故适用于测定与标准蛋酸，可校正）。故适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质，不适合白质氨基酸组成相似的蛋白质，不适合血清等组成复杂的蛋白质测定，特别适血清等组成复杂的蛋白质测定，特别适用于柱层析洗脱液的快速连
