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1、第五章第五章 细菌基因重组及遗传分析细菌基因重组及遗传分析基基因因重重组组（gene recombination）是是指指不不同同来来源源的的遗遗传传物物质质通通过过转转移移和和交交换换而而重重新新组组合合的的过过程程。高高等等动动植植物物和和许许多多产产生生有有性性孢孢子子的的真真核核微微生生物物的的基基因因重重组都是通过有性世组都是通过有性世代代来完成。来完成。在细菌中，提供部分遗传在细菌中，提供部分遗传物质或少数基因的一方称物质或少数基因的一方称为供体（为供体（donor），而获得），而获得基因的另一方称为受体基因的另一方称为受体（recipient）。）。第一节第一节 转化（转化（Tr
2、ansformation）转化：转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的因型细胞的DNA而使受体的基因型和表型发生相应变化的现而使受体的基因型和表型发生相应变化的现象。转化现象的发现和转化因子的证实对促进现代分子生物象。转化现象的发现和转化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨大的推动作用。学的诞生和发展产生了巨大的推动作用。 在在实实验验室室条条件件下下，通通常常用用CaCl2、cAMP、低低温温培培养养、PEG介介导导及及电电脉脉冲冲等等方方法法转转化化细细菌菌或或其其它它微微生生物物。细细菌菌转转化化的的过过
3、程程大体可分为三个阶段：大体可分为三个阶段：感受态的出现感受态的出现DNA的吸附和进入的吸附和进入DNA的整合的整合1.感受态的出现感受态的出现 感受态（感受态（competence）：）：是指受体是指受体菌菌细胞最容易接受外源细胞最容易接受外源DNA并使之不被并使之不被DNA酶降解的生理状态。酶降解的生理状态。一、转化过程和机制一、转化过程和机制 细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋白（白（5-10 kD）。这种感受态因子可与细胞表面受体蛋白结）。这种感受态因子可与细胞表面受体蛋白结合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中包括细胞壁自
4、溶素。合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中包括细胞壁自溶素。自溶素使细胞表面的自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与其具有与DNA结合的活性。因此，当细菌表面出现许多结合的活性。因此，当细菌表面出现许多DNA结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。 4. 进进入入细细胞胞的的单单链链与与寄寄主主DNA同同源源区区重重组组并整合到染色体上并整合到染色体上革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌1. 双链双链DNA片段在片段在DNA结合蛋白（黑结合蛋白（黑色点）的帮助下吸附到细胞表面并由色点）的帮助下吸附到细胞表面并由核酸酶（紫色
5、椭圆）切成缺口核酸酶（紫色椭圆）切成缺口2. 由核酸酶降解由核酸酶降解其中一条单链其中一条单链3. 未被降解的单链与未被降解的单链与感受态特异蛋白相互感受态特异蛋白相互作用并进入细胞作用并进入细胞2.DNA的吸附和进入的吸附和进入 在流感嗜血在流感嗜血菌菌中，其感受态细中，其感受态细胞形成一种结合双链胞形成一种结合双链DNA的的膜结构，称为转化小体膜结构，称为转化小体（transformasome）。该小体）。该小体吸附吸附DNA后，与细胞的内外后，与细胞的内外膜相融合而转入细胞内侧，再膜相融合而转入细胞内侧，再将双链变成单链将双链变成单链DNA。 转化小体转化小体双链双链DNA被转被转化小体
6、摄取化小体摄取转化的双链转化的双链DNA（30-50kb）结合到膜受体上结合到膜受体上很快进行同源重组很快进行同源重组使外源使外源DNA整合到整合到染色体上染色体上革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌DNA在进入感受态细胞在进入感受态细胞之之前，要经过可逆性吸附和不可逆性前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。吸附。可逆吸附的可逆吸附的DNA对对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不可逆吸附可逆吸附DNA对对DNA酶不敏感。酶不敏感。吸附到细胞表面是双链吸附到细胞表面是双
7、链DNA，而不是单链，而不是单链DNA实实验验证证明明：肺肺炎炎链链球球菌菌的的转转化化因因子子在在100下下逐逐渐渐失失去去转转化化活性活性(DNA发生变性发生变性)。在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复(单链单链DNA复性成双链复性成双链)。说说明明完完整整的的DNA双双链链结结构构对对于于转转化化活活性性来来说说是是必必要要的的，转转化化的的第第一一步步，需需要要双双链链DNA才才能能结结合合到到细细胞胞表表面面的的结结合合位位点上。点上。当当DNA吸附后，被酶解开成单链吸附后，被酶解开成单链DNA，只有单链，只有单链DNA才才能进入细胞内并与受体染色体能进入细胞内并
8、与受体染色体DNA进行整合。进行整合。 流感嗜血菌特异性摄取序列：流感嗜血菌特异性摄取序列： 5AAGTGCGGTCA 3淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：5GCCGTCTCAA 3在在流流感感嗜嗜血血菌菌的的染染色色体体上上有有600个个拷拷贝贝的的摄摄取取序序列列。摄摄取取序序列列虽虽然然只只有有10-12bp，但但很很少少随随机机地地出出现现在在其其他他物物种种的的DNA序列中，因此这些细菌对外源序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。的吸收具有选择性。为什么有些细菌对摄取的为什么有些细菌对摄取的DNA有特异性要求呢？有特异性要求呢？近年来的研究表明，近年
9、来的研究表明，G-菌和菌和G菌对单链菌对单链DNA也能进行有效也能进行有效转化，但一般是在较低的转化，但一般是在较低的pH值下进行的。值下进行的。外源外源DNA片段在受体细片段在受体细胞中的命运：外源胞中的命运：外源DNA（红色）（红色）转化到受转化到受体细胞后，通过同源重体细胞后，通过同源重组整合到染色体上，否组整合到染色体上，否则被降解成核苷酸。则被降解成核苷酸。 3.DNA的整合的整合 转转化化为为相相同同或或相相近近物物种种之之间间的的同同源源重重组组提提供供了了可可能能性性，是是自自然然界界中中基基因因交交换换的的一一条条重重要要途途径径，在在生生物物变变异异和和进进化化中中起起着着
10、重重要要作用。作用。转化的效率决定于下列三个内在因素：转化的效率决定于下列三个内在因素：受体细胞的感受态，决定转化受体细胞的感受态，决定转化DNA能否进入细胞能否进入细胞受体细胞的限制系统，决定转化受体细胞的限制系统，决定转化DNA在整合前是否被分解在整合前是否被分解供体和受体供体和受体DNA的同源性，决定转化的同源性，决定转化DNA的整合。由于转的整合。由于转化化DNA总是与顺序相同或相似的受体总是与顺序相同或相似的受体DNA配合，所以亲缘配合，所以亲缘关系越近的其同源性也越强，转化效率也越高。关系越近的其同源性也越强，转化效率也越高。二、人工转化二、人工转化 1.通过二价阳离子处理，大肠杆
11、菌等部分通过二价阳离子处理，大肠杆菌等部分G-细菌能产生细菌能产生感受态感受态2.通过制备原生质，大多数细菌特别是某些通过制备原生质，大多数细菌特别是某些G+细菌细菌 已知许多细菌包括大肠杆菌均无自然转化的能力，但经已知许多细菌包括大肠杆菌均无自然转化的能力，但经人工诱导可使它们形成感受态。如：人工诱导可使它们形成感受态。如：1970年年Mandel和和Higa首首先先发发现现DNA在在含含有有高高浓浓度度Ca2+的的条条件件下下能能够够被被受受体体细细胞胞摄摄入入和和转转化化，随随后后的的实实验验证证明明由由Ca2+诱诱导导的的人人工工转转化化的的大大肠肠杆杆菌菌中中，其其转转化化DNA必必
12、须须是是一一种种独独立立DNA复制子。复制子。1.大大肠肠杆菌的杆菌的转转化化随随着着研研究究技技术术的的改改进进和和经经验验的的积积累累，人人们们已已经经建建立立了了用用Ca2+、Mg2+等等诱诱导导转转化化的的标标准准程程序序，能能对对大大肠肠杆杆菌菌菌菌株株C600、JMl01、JMl09、DH5a等进行有效的转化。等进行有效的转化。先将大肠杆菌培养至先将大肠杆菌培养至OD600=0.51接着用接着用50-100mmolL CaCl2处理制备成感受态细胞处理制备成感受态细胞然后将然后将DNA与感受态细胞混合与感受态细胞混合在冰浴中反应在冰浴中反应20-40min进行进行42热击可增加热击
13、可增加DNA的吸收（的吸收（107个转化子个转化子/ug质粒质粒DNA ）最经典的转化方法是：最经典的转化方法是：由于异源的质粒由于异源的质粒DNA分子能够进入大肠杆菌细胞，所分子能够进入大肠杆菌细胞，所以大肠杆菌摄取以大肠杆菌摄取DNA是非选择性的。是非选择性的。2.PEG介介导导的的转转化化不能自然形成感受态的不能自然形成感受态的G+细菌如枯草芽孢杆菌和放线菌，细菌如枯草芽孢杆菌和放线菌，可通过可通过聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，一般用，一般用PEG 6000)的作用实现转化。的作用实现转化。这类细菌必须首先用细胞壁降解酶完全除去它们的肽聚糖这类细菌必须
14、首先用细胞壁降解酶完全除去它们的肽聚糖层，然后使其维持在等渗的培养基中，在层，然后使其维持在等渗的培养基中，在PEG存在下，质存在下，质粒或噬菌体粒或噬菌体DNA可被高效地导入原生质体。可被高效地导入原生质体。3.电脉冲法（电脉冲法（电穿孔法电穿孔法 ）在在许许多多细细菌菌和和真真核核系系统统中中，它它们们既既无无自自然然的的感感受受态态呈呈现现也也不不能能用用上上述述的的方方法法建建立立感感受受态态。因因此此人人们们发发展展了了一一种种新新的的将将核核酸酸分分子子导导入入细细胞胞的的方方法法，最最突突出出的的是是电电穿穿孔孔(electroporation)法和基因枪法和基因枪(biolis
15、tic)转化法转化法。 电穿孔法：电穿孔法：是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击成是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击成小孔，使各种大分子小孔，使各种大分子(包括包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，能通过这些小孔进入细胞，所以又称电转化。所以又称电转化。 电场强度、电脉冲的长度和电场强度、电脉冲的长度和DNA浓度浓度4.基因枪基因枪(biolistic)转化转化 基基因因枪枪转转化化法法首首先先由由Sanford报报道道，该该方方法法是是将将包包裹裹有有DNA的的钨钨颗颗粒粒像像子子弹弹一一样样用用高高压压射射进进细细胞胞并并使使DNA留留在在细细胞胞内内，特别是留在细胞器中。特别是留在细
16、胞器中。用用这这种种方方法法首首次次成成功功地地将将DNA导导入入酵酵母母线线粒粒体体并并引引起起线线粒粒体体遗传变化。基因枪转化现在被广泛地应用于植物的转化中遗传变化。基因枪转化现在被广泛地应用于植物的转化中三、建立转化方法的策略三、建立转化方法的策略 1.被转化对象（转化受体）被转化对象（转化受体）2.转化转化DNA的构建（目的）的构建（目的）3.转化方法选择转化方法选择四、转化应用四、转化应用 在在转转化化中中，如如果果转转化化因因子子的的两两个个基基因因是是连连锁锁的的，那那么么它它们们可可以以同同时时被被转转化化，也也称称为为共共转转化化，连连锁锁的的两两个个基基因因距距离离越越近近，其其共共转转化化频频率率越越高高，反反之之则则低低。利利用用共共转转化化率率和和连连锁锁的的二二基基因因间间的的距距离离的的反反比比关关系系可可进进行行基基因定位的工作。因定位的工作。1. 连锁检测连锁检测2. 遗传图谱的绘制遗传图谱的绘制基因型基因型数目数目trp2his2tyr1+11940+3360+685+418+2600+107+1180trp2+his2+tyr1+（供体）（供体）
