不同抗热性小麦品种热激蛋白的SDS—PAGE分析刘植义沈银柱黄占景司智海杜晓明朱登祥孙富强 •河北师范大学生物系提要*特不同抗热性小瓷品种的幼苗进ft 43°C高温的不同时间处理，对其水溶性蛋白质进行SDS—PAGE分折，发＜HS可诱导小麦动 苗合 成许多 HSP,同时有些正希蛋白质的合成受到抑制,水落性蛋白质盂童及有些蛋白 质的含量也发生明显的变化；HSP的生成量高峰出现的时期写小麦抗热惟有 关由此可以检测不同小瓷品种的抗热牲能，为选育抗热品种提供依据自1962年Ritossa等入」勺在果绳上发现HS （热刺徼）可诱导细胞产生HSP （Heat Shock Protein,热激蛋白）以來，许多学者进一步的研究表明HS效应不仅 存在于果绳，而且广泛地存在于从细菌到人的整个生物界【“町对于高等植物中的HSP 的研究，则是从80年代才开始的何有人对烟草门■番茄【⑴、玉米「町、大豆 等作物的细胞.组织或者完整的植株幼苗，从适宜的生长温度（25・C〜280 下突然 转移到高温（37°C. 40°C. 43°C等〉下培养，它们和动物细胞一样，在短时间内大邯 分正常蛋白质的合成被抑制，同时，诱导合成少蜀的MSP,说明这类殒白质的主要功能 是提高细胞的应激能力，特别是耐热能力°我国学者张孔港等人W】，对高梁雄性不 谒系及其保持系也进行了HS效应的研究。
有关小麦HSP的研究，冃前国内还未见系统 的扳ML我们均了研究小麦HSP基因的调控与表达，对抗热性不同的冬小友品系幼苗进 行了不同时间的HS处理，通过对水溶性蛋白质的电泳分析，探讨HS对冬小麦蛋白质合成 的影响.以及小麦抗热性与HSP之间的关系，进而为农业生产上对不同小麦品系抗热性 的生化检测提供一些依据，为选育血抗热性的小麦品种提供畚考生理指标材料和方法一、材料供试材料有抗热性強和抗热性询的两个小变品系78Z124和78052小麦种子由藁城 县农技推广中心提供■ • 1 • i “ — • —1^—■ 一 — ■♦实丈1988平8月完成■二. 方法1, 材料处理将小麦种子于10%升汞中浸迤八分钟后用淸水冲洗・铺在垫冇两层滤纸的培养皿 中，水及12小时，址光照培养箱内横温（259）培养4天左右・此时苗髙平沟8 II米 将一部分苗取出，作为对照（ck）,其余的仍昭在培养箱内进行HS处理迅速升温至 13°C,分别处理4小时、12小时和24小时然后称取去掉IB及胚乳的幼苗1克，用璽 蒸水冲洗，滤纸吸干，剪碎，放在倾冷的研钵中，再加入1臺升0.25MpH6.8Tris・ HC1缓冲液，在冰浴条件下研瘠成匀浆。
将匀浆冷冻离心（0 —4 °C, 18,000rpm） 30分钟，收集上清液，^4°C冰箱中保存待用2、 制样分别取上清液.甘汕及样品处理液（3 %统基乙醇.2.5%SDS,以0.625MpH6・8 Tris—HC1缓冲液配制）按2 ： 1 ： 3的比例混合后，于沸水浴史加热3分钟，即可 点样电泳8、电泳.染色及脱色 ■本实验采用Laemmli^SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）的方法并稍 加修改，分离胶的浓度T= 12%,浓缩胶的浓度T=5%待胶凝固后点样，待测样品 点样量为40原/孔，标准蛋白点样量为Sul/孔.在上、下槽倒上电泳缓冲液（PH8.3 Tris-Gly缓冲液）后,在室温下先加压至100伏，待样品泳至浓缩胶与分离胶的界面 时，再加大电压到150伏.然后保持150伏恒压进行电泳约2.5小时 电泳完毕后，用 0.1%考马斯亮兰R—250在40恒温条件下染色2小时，再用冰乙酸一甲醇溶液（浚 度分別为7.5%和10%）脱色至背杲呈现无色°4、胶板的处理对电泳胶板先进行照相，于CS—930薄层扫描系统上在590am处扫描，然后用BIO 一RAD公司生产的443型胶扳干燥器制成干胶板。
最后对这些谱带进行分析♦结果和分斯一、可溶性蛋白质种类的变化通过对不同处理小麦幼苗水溶性蛋白质进行SDS—PAGE分析,小麦苗期的电泳 图谱可显示出40〜50蛋白质条带C图1和图2）热激（HS）处理后，有15〜16个蛋 白质条带发生了变化我们根据标准®GlgMW-Rf标准曲线（图8〉计算了这些蛋 白质的分子鈕c抗热品系78 — Z124经HS处理后有15条曲发生了增减（表L），不抗热品 系78-052有16条带发生了变化（表2） 9这些变化的蛋白质主要集中在两个区域|离 分子量的70〜95kd区域和低分子址的30、50kd区域这一点与梅尚筠等人〔⑴的报逍 相近这也就是说小麦和其他生物一样，HS诱导产生的HSPhT以粗略地分成两类二一 类是高分子扯的热激蛋白（HMW—hsp” 一类是低分子量的热激蛋白（LMW—hsp） 在这两类蛋白质中.HMW—hsp较少,LMW—hsp较多，在实验的两个品系中，有些新 合成的蛋白屍
我幻初步认为这 些蛋白质可能是HS后诱发的HSP.它啊与提 离细胞应激能力・特别是耐热能力相关这些 新合成东白质出现的早晚，可能反映了有关穗 激蛋白基因启动的难易程度，也反映了它＜1与 耐热有关的程度，这里至关重耍的可能是MW 为17.7kd的基因及其产物另外有些新合成 的蛋白质 是不同 的如95.8kd、89.91cd、示缺失$ " + "示存在iii 示缺失丿“ +龙示存在87.7kd和25.9kd等（农丄、衣2）这种差别可能与品种特性及其基因型有关在诱导 合成HSP的同时，也和其他作物上的报道-样ru'13j ,有些正常的蛋白质如52.7kd、 48.8kd. 35.6kd等的合成完全被抑制〈表1、图1）c在所冇处理中，两个小麦品系HSF条带出现眾多的时期均任卜IS处理12小吋后山 此可见，这些HS后新台成的HSP足轲抗热有直接关系的蛋白质它们很可能是小麦这 一类作物受到煥剌激后的规律性反映其中抗热品系特有的新合成的贡白质如95.9kd、 25.91 kd都可能是小麦抗热性的峑础°二、可榕性蛋白质含址的变化HS处理后，小麦幼苗水溶性蛋白质的舍址賞生一些变化首先，从蛋白质合成总虽的变化上来看，反映了不同抗热性品种的差异。
我们将蛋 白谱带扫描曲线各曄面积枳分，对处理时间作曲线，不同品种小麦所得结果如图4所示,® 4 不同小麦品系水港性蛋白总jttffiHS时间不同的变化抗热品系78Z12如b、不抗撚品系78052从图4可以看出，庄HS条件下，不同品系小変赏白总鈕都有所増加，在处理4小 时达到高峰，以后蛋口总乂下降°但下降峪势冇所不同■抗热性强的小麦骷系78-Z124 下降幅度较小，曲线较缓，说明左校长时何HS处理下仍能合成大址蛋口质｝而抗热性 弱的小麦品系78—052,其蛋白总量在HS较短时间（4小时 '内出现高擁.但时间延 长，蛋白含股下降很迅速「虫可能就足抗热性弱的小麦对热刺激敏感的内在农现其次，从电泳图谱及扫描曲线（图訐）上可以看出，在HS条件下，有些蛋口质的 含it发生了变化〈表8）在热剌激时，71.4kd和55.93的蛋口质含凰1;匕对照（CK） 宥所增加.其中78—Z12d在HS32小时时它们达到巖大值，24小时以后开始下降｝而78 一052在HS4小时叶出现育稣,创12小时•迅速下降.土干这性增加的蛋臼质是原盗白 质合成萤的摺加，还是质具育柑冏分了但的HSP的合成，有亦进一步检测78Z—12478—052处理闪(HJ分子址
在有些蛋白质含匮增加的同时，有些蛋白质的含总却BfiHS时佃的延氏而呈下降趋 势垠明显的有两条带纹变栈，它们的兮子疑分别为32.4kd和31.63,这说明HS对 有些正常蛋白质的合成起抑制作用三. HSP合成高嫁川现的时期及延续的吋间据Lin等人3】报道，植物在40°C短料处理后，恢复到2計C时，HSP的合成能以 鬲水平持绫2 —3小时，然后逐渐下降Barnett 在烟草懺部细胞上也发现了类似现欽我们从扫描•仙线（图5〉发现，抗热性前小麦品系7S-Z12J,其HSP含蛍鬲蛛 出现在絞晚的时间（12小时〉，这可能与抗热类型的热激直白肚因表达不易激活有关 但是它们的HSP合成高岭持线时间絞比 可见这些基囚一旦启动就不易关闭而耐热性 購的小麦品系78—052的HSP含晁高峰出现的钱早＜4小时），但持续时间短（图4、5）o 说明不抗热类型的热激蛋口站因容易激活，不过其墓因活性常常被持续的离温所肌抑 由此我们认為山于78Z124能较忆吋间地合成HSP.所以抗热性延续的时间就长）相 反・78052只在短期内合成HSP,所以抗烦性延皺的时问短，HS时间稍延长，小麦幼苗 严则不能忍受这说明，HSP含肚出现高峰的时期不同，HSP合成高峰的持续时间的差 *异，可能就是供试的两个小麦品系抗热性不同的原因。
通过对不同抗热性品种冬小麦幼苗水溶性蛋白阪进行SD5—PAGE,发现了HSP的 变化与小麦抗热性的关系，抵此可以快速椅测川抗丁热凤的咎小老品种，为选育小麦新 品种服务 .H5S5 不同抗热性小麦品种各处理热激送白扫描曲线注* a ” #处理对照扌三描曲线.w一” #处理不同时间HS后扫描曲线5 — 1, 5 — 3 9 5 — 5是抗热性爲系78Z—'124依次HS 4、12、24小时后的扫描曲线°5 — 2、5 — 4、5 。