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1、湖南瑕业乂曇高等教育自学考试本科生毕业论文人工复制小鼠铜离子中毒的病理变化观察学生姓名：考籍号：年级专业：2009级畜牧兽医指导老师：学 院：动物科学技术学院湖南长沙提交日期：2010年3月湖南农业大学高等教育自学考试本科生毕业论文诚信声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文（设计）是本人在指导老 师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对木文的研究做出重要贡献的个人和集体 在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法 律结果由本人承担。毕业论文（设计）作者签名:年 月摘
2、要:4关键）呵：41前言42材料与方法62. 1试脸材料62. 1. 1试验动物:62. 12实验试剂和仪器： 62. 2实验方法62. 2. 1动物分组:62. 2.2临床观察： 62. 2.3病理组织学观察: 63结果与分析73. 1临床症状与大体病理变化7 3. 2病理组织学变化4讨论105结论11参考文献：11致 谢12人工复制小鼠铜离子中毒的病理变化观察作 者：陈青山指导老师：李德亮(湖南省农业大学动物科学技术学院，长沙410128)摘 要:本硏究采用硫酸铜灌胃的方式対小鼠铜中毒的临床表现及组织器官的病理变化 进行观察。试验根据灌胃的剂量将实验小鼠随机分为4组：对照组(0 mg/kg
3、).低剂量纟fl (50mg/kg)、中剂量组(100mg/kg),高剂量组(200mg/kg),每组6只，试验周期为2周。 结果显示，髙剂量组的死亡率高于中剂量和低剂量组。高剂量组器官的病理形态学观察表现 为肝脂肪变性和颗粒变性，肝细胞呈现蜂窝状外观，低剂量组和中剂量纟HT细胞肿人，胞浆 内充满红染的细微颗粒；低剂疑组中廿小管出现颗粒变性，肾小管上皮细胞肿胀，使管腔变 小或狭窄，间质毛细血管扩张，充血。中剂量组廿小管出现明显颗粒变性，管腔中有许多红 染蛋白质物质，出现管型。部分肾小管舉细胞结构被破坏。高剂量组肾小管上皮坏死、崩解、 脱落于管腔中。结果表明，铜中毒主要损害肝脏、肾脏等组织器官，
4、最终导致发病其至死亡。关键词：铜中毒；病理变化；小白鼠；1前言铜元索普遍存在于动物、植物和微生物体内，是所有低等动物和脊椎动物必 需的微量元索之一。自1925年被首次报道后，铜作为动植物营养必需微量元索 的作用逐渐被人们所认识并不断被研究。研究表明，在饲料中添加适量的铜， 可明显提高动物的生产性能。铜的这种特殊生物学作用，在现代畜牧业中已被广 泛应用，并取得了较好的经济效益。近年來，由于饲料中铜的过量添加而导致的 动物中毒现象常有吋有发生叫 许多铜盐如硫酸铜、次醋酸铜、碳酸铜、氯化铜、 氧化亚铜、硝酸铜、石油酸铜、三氯酚铜等作为沙虫剂、浸种剂、杀真菌剂、驱 虫剂、灭螺剂或木材防腐剂被广泛的使用
5、也常常给家畜养殖带來巨大的潜在危 险，动物误食铜盐后就会发生铜中毒。此外，-些植物含有毗咯类生物碱的有毒 植物(如三叶草、千里光、和天养莱属植物)能够增强铜与肝脏的亲和力、使铜 在肝脏蓄积而不能正常排出；另-些含有肝毒性生物碱的植物会造成动物肝细胞 的损伤，从而使铜在肝脏的代谢出现异常，也能使动物体内囂铜过多而中毒。 虽然动物每口摄入铜的含量没有达到中毒剂量，但是动物口粮中钥的含量非常低 或H粮中铜/钳的比值过高（大于10）,也能造成铜在动物肝脏内蓄积，蓄积过量 时动物出现铜中毒症，有报道羔羊在补饲向日葵（钳/铝比值大于10）后，出现 慢性铜中毒症状国。铜中毒的发生，往往会给养殖业带来巨大的经
6、济损失。因 此，及时掌握动物铜中毒后的临床表现及其对机体组织器官的病理损害，从而探 讨发病机理将会对铜小毒的临床诊断和基础研究提供重要的指导意义。己有的研究表明，各种动物对铜的毒性作用和铜的敏感性存在有较大的差异10 o绵羊敏感性最高，反刍动物次之，高于其它动物性中毒剂量的报道也不经 相同：羔羊 25-50 mg/kg,绵羊 20-110mg/kg 151,奶牛 200-880 mg/kg7,奶牛 200mg/kg8,蛋鸡 500mg/kg,猪为 250-400 mg/kg 17；兔 200 mg/kg叫马 800 mg/kg,大鼠 1000 mg/kg,肉鸡 300 mg/kg 口，鸭 30
7、0mg/kg,鹅 100 mg/kg。 动物铜中毒的研究主要集中于中毒剂量，临床表现，病理变化，血液生化指标以 及发病机理等方而，在蓄积至一定阶段后，会突然出现严重的溶血，肝肾损伤， 并最终死亡。动物发生铜小毒时，6磷酸葡萄糖脱氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶 活性降低，血内氨酸氨基转移酶，天门冬氨酸氨基转移酶，乳酸脱氢酶等酶活性 升高叭动物的铜中毒习惯上分为急性中毒和慢性中毒。急性铜中毒主要以明显的胃 肠炎为临床症状，表现为恶心、流涎、腹泻、剧烈腹痛叫 慢性铜中毒主要以 溶血症状为主要临床症状，据国内报道，王幼名和王长青等做了猪中毒的研究， 临床表现如下性中毒时精神沉郁、食欲废绝、呕吐、腹痛、腹泻,
8、肌肉松弛，排 黑色稀粪，胃与十二指肠粘膜见有出血、溃疡、坏死病变，肝脏肿大呈土黄色。 徐善良和杨云林等做了山羊的铜中毒研究，具体症状如下：铜中毒时病理剖检变 化以胃肠粘膜糜烂脱落、溃疡、出血为特征说】。党晓鹏和齐长明等做了绵羊的 研究，具体症状如下：心外膜出血，肝脏肿大胆囊扩张，肾脏表而有岀血点卩。 舒港亮，翟国东和朱秀琴做了鸡的研究，结果如下：急性铜中毒最后痉挛而死， 中毒临床症状:拉稀，缩头伏地.食欲废绝，精神沉郁，腿部肌肉麻痹，呼吸困难, 剖检可见肝脏肿大，呈块状土黄色胃粘膜充血，其中十二指肠较严重，胆囊肿大11O本实验通过研究小鼠铜中毒，了解和观察铜离子对小鼠心、肝、脾、肺、肾 的影响
9、，从血研究铜中毒对机体器官组织的病理损害，探讨发病机理，为临床诊 断和基础研究提供科学依据。2材料与方法2.1试验材料2.1.1试验动物：昆明种小白鼠（24只，体重18g-22g），购买于湖南吉首大学医学院实验动 物中心。饲养室温度23C27C,每天光照12ho2.1.2实验试剂和仪器：乙醇（湖南江虹试剂有限公司）、二甲苯（上海实验试剂有限公司）、苏木素 （上海标本模型厂）、伊红染色素（上海试剂三厂）、切片石蜡（上海标本模型厂）、 中性树胶（上海标本模型厂）、福尔马林、碳酸锂饱和液等。Motic奥林巴斯显微摄影系统、YD202型石蜡切片机。2.2实验方法2.2.1动物分组室内暂养一周后，试验小
10、鼠被随机分成四组：对照组、低剂量组（50mg/kg）, 中剂量组（100吨/kg）、高剂量组（200mg/kg）o硫酸铜溶液经口灌胃小鼠，对照 组以等量生理盐水代替硫酸铜。每天中午进行灌胃，不限饮水，自由采食，共连 续灌胃15 d。试验期间，温度在22C26C,光照12 ho2.2.2临床观察试验期间每日进行临床观察，纪录临床症状。在试验进行的第10天和11 天，高剂量组有3只小白鼠死亡，中剂量组在第14天有1只小白鼠死亡。死 亡的小白鼠立即为天取其脏器，余下的小白鼠在试验期满吋采用人工脱颈致死法 进行剖杀，并取心、肝、脾、肺、肾进行观察，之后放入福尔马林固定液中固定。2.2.3病理组织学观察
11、（1）取材：取病变与正常组织的交界处的实质脏器（心、肝、脾、肺、肾）。（2）固定：将所取病料置10%的福尔马林固定液中固定48 h,在固定6h小 吋后，对组织块进行修块。将修好的组织块放于白色的小包埋盒中，按设定好的程序进行脱水、透明、浸蜡，其具体的程序步骤为水洗-80%洒精lh-90%酒 精 1.5h-95% 酒精 2h95%酒精 2100%酒精 lh100%酒精 1.5100% 酒精1.5h二甲苯0.5h二甲苯lh石蜡2h石蜡2h。（3）包埋：将小包埋盒的盖子去掉，将组织块从包埋盒中用小银子轻轻取出, 取出吋注意仍将要切的面朝下，平放在已滴满石蜡的不锈钢包埋盒的中央位置, 这一点非常重要，
12、否则会将要切的而切不完整，放好组织块后，将白色的小包盒 底部镶嵌在不锈钢包埋的上方，再在其上滴满石蜡。随后将已包埋好的不锈钢小 包埋盒冷却使其凝固。当组织块己完全与石蜡凝固结合在一起时，将不锈钢包埋 盒轻轻从要切的组织块底部轻轻去掉，将留有组织块的口色小包埋盒侧面的石蜡 轻轻刮去。（4）切片：将保留在白色小包埋盒的组织块固定在石蜡切片机上，先行修片, 半修到完整的组织时，将切片的厚度调到5-7gm,再行切片，切片吋注意用力 均匀，进行连续切片。（5）展片、摊片与烘片：将切好的组织薄片用毛笔刷轻轻挑起，同吋用小锡 子轻轻将切好的组织薄片的起始部夹起，放入水浴锅展片，温度为4550C。温 度过高可
13、将切片熔化，过低则切片不宜仲展。切片放入展片槽中时，立即用小锡 子轻轻在其上而将其有皱缩的地方展平，此吋将已准备好的载玻片垂直仲入液面 下在载玻片的1/3处将薄层切片缓缓涝起，切片可自动贴附于载玻片上，将载 玻片放在切片架上，再将其放在摊片架上。最后再将切片架移到烘片箱中烘干（烘 片箱中的温度为76C）, 一般持续吋间为40mino（6）脱蜡、染色与封藏：将放有载玻片的染色架放入二甲苯I中浸泡10 min二甲苯II中浸泡10min（以充分脱蜡）-100%酒精5min-100%酒精 5 min-95%酒精5 min -85%酒精5 min-80%酒精5 min苏木素染液染色水洗（将切片架放入事先
14、准备好的清水中冲洗5 min） 1%盐酸酒精分化 （这一步骤相当关键，它的主要H的是脱去胞浆的着色，时间过长可使胞核的着 色脱去。）放进去后要迅速取出，吋间一般掌握在46秒钟一自來水缓缓冲洗 15-30 min-伊红染液染色13分钟95%酒精3s100%酒精3s-100%酒精 3s-二甲苯I 3s-二甲苯II 3so至此H.E染色过程全部结束，将染色架上的 载玻片取出，用干净的纱布将二甲苯液体蘸去，并在上面滴上中性树胶，将盖玻 片封好，贴上标签作好标记后放入切片盒中，观察各个脏器的病理变化。3结果与分析3.1临床症状与病理变化高剂量组临床表现食欲废绝，精神沉郁，缩头，全身震颤，卧地不起，排黑
15、褐色粪，脾脏体积缩小，重量减轻，色泽变淡，肝呈黄褐色，质脆易碎，胆囊膨 大充满蓝绿色胆汁，死广病例还可见肾轻度肿大。中等剂量组表现为食欲废绝， 精神沉郁，脾脏体积缩小，重量减轻，色泽变淡，肝呈黄褐色。低剂量组的无明 显的变化。3.2病理组织学变化肝脏：低剂量组和中剂量组肝细胞肿大，胞浆内充满红染的细微颗粒，中央 静脉、肝窦以及间质小血管内充满红细胞。高剂量组肝脏出现明显颗粒变性和脂 肪变性，肝细胞肿大，胞浆内充满大量红染的细微颗粒或圆形空泡，细胞呈现蜂 窝状外观（图l）o部分病例可见局灶性坏死，内肝细胞索排列紊乱，肝细胞胞浆 红染，细胞核出现固缩和碎裂（图2）o ip央静脉内红细胞不清楚，只见红染丝网 状物质充满血管。图1肝细胞呈蜂窝状图2肝细胞核固缩和碎裂心脏：在中剂量组和高剂量组可见心肌纤维肿胀，出现许多红染的细微颗粒 （图3）。心肌纤维间毛细血管内充满红细胞。脾脏：在中剂量组和高剂量组可见脾脏白髓区变小，中央淋巴细胞和边缘区 淋巴细胞数量减少，网状细胞增生，红髓血窦扩张充血（图4）。高剂量组部分 病例脾脏白髓淋巴细胞出现坏死。图3肌纤维肿胀和细微颗粒图4红髓血窦扩张充血肺：在中剂量和高剂量组中小血管和
