贵阳医学院医学生物技术专业酶工程论文（2010 级）题 目 端粒酶——肿瘤治疗研究新方向班 级 医学生物技术专业2010级2013年11月18日学生姓名 周冰峰 龙妮娅 完成日期端粒酶一一肿瘤治疗研究新方向周冰峰龙妮娅摘要：端粒(telomere)是存在于真核细胞染色体末端的一段富含GC串联重复 序列的结构；端粒酶(telomerase)是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体, 为RNA依赖的DNA聚合酶，也即逆传录酶，可以催化端粒DNA的合成正常人体 细胞的端粒酶活性检测呈阴性，而在85%以上恶性肿瘤患者的肿瘤细胞中端粒酶 是高度活跃的，呈现阳性，也即在端粒酶作用下，肿瘤细胞染色体端粒不会随细 胞分裂而缩短，因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标， 我们可以运用端粒酶作为治疗肿瘤的靶点，为肿瘤治疗捉供一个新的研究方向关键词：端粒端粒酶细胞肿瘤治疗一、端粒和端粒酶的发现(一)端粒早在20世纪30年代，诺贝尔奖得主Hermnn Muller和Barbara Mcclintock 已经观测到染色体的末端结构在避免染色体Z间的融合起到重要的作用，从而猜 测它可能冇保护染色体的作用"②，之后，在20世纪70年代初对DNA聚合酶特 性的深入研究引申出染色体并没冇随着复制后RNA引物的降解而缩短，其自然末 端也没冇相互融合，这就暗示了有一个特殊的结构在保护染色体复制过程中免遭 融合、缩短，由此，人们把染色体末端这一特殊结构定义为 端粒(telomere)O(-)端粒酶真核生物DNA的复制只能沿着5, — 3,方向进行，并需要冇互补单链作模 板，述要求冇一定长度的RNA作为引物。
随着引物的切除，随从链5,末端总有 一段相当于RNA引物长度的DNA不能完整复制下来，这必然导致染色体DNA随着 每一次的细胞分裂其端区不断缩短，这就是Warson于1972年提出的“末端复制 问题(end replication problem) ⑷但 Larson 和 Spangler 等在对对数生长 期的四膜虫的研究中却发现其端区不见缩短，其至述冇所延长针对这一孑盾，Blackburn和Greider等⑸认为四膜虫端区的延长不可能是DNA聚合酶作用的结 果，而是另有原因后来他们在四膜虫的细胞提取液中发现了一种酶活性成分, 能往端粒区添加重复序列TTGGGG,当时称之为末端转移酶，这就是现在所称的 端粒酶（telomerase）端粒酶的结构和作用机制（一）端粒酶的结构端粒酶是一种特殊的核糖核蛋口酶复合体，具有逆转录酶活性.能够以自身的RNA为模板合成端粒DNA端粒酶结构主要包括3部分:端粒酶RNA （telomeraseRXA, TR)；端粒酶催化亚单位(telomerase catalytic subunit, TERT)和端粒酶 相关蛋白质 1 (telomerase associated, protein 1, TP1 / TLP1)；另外，还有 hSP90 (heat shock protein 90), p23和dyskerin等⑹。
这其中最关键的结构就 是 TR 和 TERTo人端粒酶RNA （hTR）主要负责指导端粒重复序列的合成，hTR的结构改变或 成分的丢失均会影响端粒酶的活性其次，端粒酶催化亚单位（hTERT）是一个 包含1132个氨基酸残基的多态链，它具有逆转录酶的共同结构，也即7个蛋口 质域以及端粒酶催化亚基独特的T框架保守区域，其编码基因位于染色体5p ±； hTERT是端粒酶起作用的关键结构和主要调控亚单位，它可以通过逆转录hTR模 板序列，合成端粒D\A重复序列并且添加到染色休末端，从而延长端粒长度端粒酶的作用机制端粒酶的活性调控，包描niRNA剪接与成熟，hTERT和hTR基因转录，不 同组分之间的定位和移位，转录后修饰，具有活性的端粒酶组合，端粒酶结合到 端粒产生延t作用等多个水平进行伴随端粒酶活性的增加，hTERT-mRNA表达 水平也相对应成一定比例增加，并且在癌细胞和正常组织中的表达有很大的不 同，据此可认定，调控人类端粒酶活性的主要亚单位是hTERT,只要hTERT表 达，其他亚单位就会与其共同构成高活性的端粒酶全酶⑺因此，端粒酶的核心 作用是延t端粒，从而维持端粒在复制分裂中保持一定长度，为细胞具有不断复 制提供遗传基础。
TR和TERT是端粒酶发挥作用的核心组分，分别提供模板和 逆转录酶合成端粒DNAo癌细胞中端粒酶的激活及活性的维持可能是多种因素在多个水平对不同分 子靶作用的结果正常组织广泛表达hTR和hTPl,而hTERT的表达被抑制，大 多数端粒酶阳性的肿瘤和永牛化细胞系中均表达hTERT；此外，在端粒酶阴性细 胞中导入hTERT即可检测到端粒酶活性，这就说明hTERT的表达与端粒活性是 平行的，hTERT的激活对肿瘤细胞中端粒晦活性的激活是“必须的和足够的”⑻ 所以在端粒酶的激活过程中hTERT基因在细胞中的表达是决定端粒酶活性的关 键叫三、 端粒酶活性的检测技术端粒酶的常用检测方法有三种：(一)端粒重复序列扩增法(telomere repeat amplification protocol, TRAP)它是端粒酶活性检测的基本方法何，在此基础上乂衍生出许多更加简便灵活 的检测方法，比如TRAP-PAGE、TRAP—ELISA等;但是对于端粒酶的活性检测的 灵敏度都会因为取样的位置不同而有所差异，总休来说，使用TRAP检测体液样 本的端粒酶活性，从提取、扩增至读取结果，用时2〜3 h,仅包含离心、加样 等基本的分子生物学检测技术操作，并且可以参考试剂盒的标准对阳性及阴性结 果进行简单、及时的判读，是一种快速、简便、灵敏的端粒酶活性检测方法。
)RT-PCR法检测hTERT的表达(三)用沖标记的端粒(CCCTAA)探针或用Hinfl和Rasl酶解的基因组 DNA杂交，检测端粒的长度四、 端粒酶在肿瘤治疗方面的应用止常细胞中的端粒酶活性检测是呈现阴性的，而85%以上恶性肿瘤细胞中的 端粒酶活性是高度表达的这就说明，肿瘤细胞的端粒酶活性因为某些原因被 激活，使端粒不断维持在一定的长度，细胞因此逃过正常的衰亡而成为无限增殖 的细胞；端粒酶活性与恶性肿瘤之间的密切关系，为肿瘤的诊断提供了有效的标 志物问因此，端粒酶是止常细胞转变为肿瘤细胞的关键性物质，是抗肿瘤治疗的重 耍靶点而月•，正常细胞与肿瘤细胞中端粒酶的表达、端粒的长度和细胞动力学 的差异，使得选择端粒酶作为约物靶标成为相对妥全有效的治疗手段3由于端粒酶活性是通过TERT基因的转录机制来严格调控的通过克隆TERT 基因启动子结构区域，研究者发现TERT基因启动子是高GC富含区，缺少TATA 盒和CAAT盒TERT基因核心启动子上存在一些潜在的传录因子结合区，如E. box (CACGTG) > SP1、C—Ests等这些结构特征使得TERT基因启动了具有高肿瘤靶 向性及较强的启动活性，从而成为肿瘤靶向基因治疗中具有巨大潜力的启动子[14]O近年来，针对端粒酶为作用靶点的抗肿瘤研究非常活跃，其研究目标就是寻 找各种冇效的途径来抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，目前主要的途径冇以下几种[15]■■(-)阻断端粒酶RNA的模板作用，包括：反义hTR、反义寡核昔酸、锤头 状核酶和肽昔酸等；我们以反义寡核苛酸为例，讲述肿瘤治疗中以反义寡核甘酸为靶点的应用; 研究发现，针对人端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 11个碱基区域的 治疗可以直接抑制端粒酶的活性，因此是寡核甘酸治疗的理想靶点。
不论端粒酶 全酶的结构如何，hTR的模板区域一定会连接到端粒的重复结构，因此就会出现 靶寡核昔酸的暴露，这为寡核昔酸介导的治疗提供了理论基础昭有报道称以 hTR为靶点的反义寡核甘酸可降低胃癌细胞系SW480 (人结肠癌细胞株)的活性, 并同时诱导其凋广(二)针对端粒酶催化亚基的抑制剂：反义hTERT抑制剂、端粒酶蛋白抗体、 PKC调节剂等;目前，对于端粒酶催化亚基的抑制剂，国内外研究的比较深入的是反义h TERT抑制剂，其抑制肿瘤的机制是：针对端粒酶RNA组分中含冇与端粒DNA序 列互补的碱基模板序列设计的反义核昔酸，它具有阻断其模板的作用，从而抑制 D7A端粒酶合成端粒DNA序列因此，反义hTERT抑制剂可以抑制肿瘤细胞的端 粒酶活性并导致细胞死亡已经有实验证明，用反义hTERT转染人Hela细胞， 发现端粒D\A逐渐丢失，经23〜26个分裂周期后细胞就开始死亡“役 这一实例 就证明了用端粒酶作为靶点去设计端粒酶抑制剂是肿瘤治疗的一个极具前景的 新方向五、结语2009年的三位诺贝尔奖得主为我们揭示了端粒保护染色体的一系列机制，以及端粒与细胞癌变、衰老Z间的密切关系，也为后来的研究者捉供了一个崭新 的研究端粒酶治疗肿瘤方面的思路和研究路线，使我们从染色体的层次深刻的认 识了肿瘤细胞，并且结合端粒酶在肿瘤细胞中的高表达特性，为肿瘤的诊断、端 粒酶靶向抗肿瘤药物的研制提供了更高效、专一的位点；尽管越来越多的端粒酶 研究都取得很好的结果，但是仍然有一些问题需要我们去解决：第一，并不是所 冇的肿瘤患者和肿瘤类型都能检测到端粒酶的活性，因此，这些细胞可能会对端 粒酶靶向的治疗方法不墩感。
第二，当端粒酶活性被抑制后，端粒的长度需耍一 段时间缩短至一定程度时才能引起细胞凋亡因此，从药物治疗开始到产生一定 的治疗作用会有一段吋间的滞后期第三，肿瘤细胞常常会启动其它补偿机制而 逃脱治疗的压力，在以端粒酶为靶向的治疗中刺激与端粒酶功能相似的其它基因 的表达这些都是需耍我们去应用生物技术解决的问题，但是，相信总有一天, 人类会利用端粒酶研究更多的端粒酶抑制药物，从根木上克服肿瘤参考文献[1]杨品红，王志陶，王志勇•端粒和端粒酶的发现及应用•生物技术通报，2010(8) :46-51⑵[3]钟天映，陈媛媛，毕利军.端粒与端粒酶的研究——解读2009年诺贝尔生 理学或医学奖•生物化学与生物物理进展,2009, 36(10): 1233-1238[4] WATSON J D. Origin of concatemerie T7 DNA[J].Nat NewBioT, 1972, 239(94):197-201[5] GREIDER C W, BLACKBURN E H. Tdentification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymenaextracts[J]. Cel 1,1985,43(2 Pt 1)： 405-413[6] 孔令平，汪华侨•端粒和端粒酶与衰老、癌症的潜在关系——2009年诺贝尔生 理学或医学奖简介.自然杂志,2009, 31 (6) :327-331[7] 朱军，丁建强，冯云.端粒、端粒酶研究及应用进展•中国医药科学,2012, 02(7): 59-62⑻卫立辛，吴孟超.端粒卿:肿瘤治疗研究的新希望•中国肿瘤牛物治疗杂志,2006, 13(5) : 325-328[9] 王峰，刁勇，许瑞安.人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子在肿瘤基因治疗中的应 用•中国生化药物杂志,2012, 33(5) :687-689[10] 刘岩,徐美林王菁，吴秉矩钊犒镐,方伟岗.端粒酶活性和免疫细胞化学在 肿瘤细胞学诊断中的应用•中华病理学杂志,2012,41 (3) : 181-185[11] 黄志伟，隋英丽•反义端粒酶RXA抑制肿瘤细胞的研究进展•中国现代普通外 科进展,2012, 15(12) :978-979[12] von Fi。