毕业论文文献综述生物技术根霉形态及其原生质体制备的研究简介摘要：根霉是霉菌中一种具有多酶系特征的霉菌，它不仅能分泌淀粉酶外，还能分泌酒 化酶及乳酸、酸性蛋白酶、琥珀酸等多种有机酸，可以在整个发酵过程中始终边糖化边 发酵连锁进行在食品酿造工业中所用的主要原料，多数含有较多的淀粉，根霉能产生 丰富的淀粉酶，使淀粉变为糖分，具有很好的糖化性能，是酿酒工业上常用的糖化菌 木文探讨介绍了根霉形态特性及其原生质体的和关研究关键词：根霉；原生质体的制备；根霉形态；根霉特性根霉属(Rhizopus)包括接合菌亚门、接合菌纲、毛霉目、毛霉科真菌中的一个大属 菌丝无隔、多核、分枝状，有匍匐菌丝和假根，借此可在基物表面广泛蔓延，不产生定 形菌落在假根的上方长出一至数根抱囊梗，顶端长球形抱子囊囊的基部冇囊托，中 间冇球形或近球形囊轴囊内产大量砲囊胞子，成熟后孑包囊壁消解或破裂，释放球形或 卵形等抱囊抱子有吋在匍匐菌丝上产生横隔，随即形成厚垣泡子有性生殖时由不同 性别的菌丝或匍匐菌丝上生出配子囊，配子囊双双异宗配合形成一•接合抱子广泛分布 于酒曲、植物残体、腐败有机物、动物粪便和土壤中有重要工业应用，如米根霉 的淀粉酶可用于制曲、酿酒，华根霉(R.chinensis)、少根根霉(R.arrhizus)等可产乳酸，匐 枝根霉(R.stolonifer, IH称黑根霉)等还能转化备族化合物。
也应用于當体激索、延胡索酸 和酶制剂的生产冇些根霉会引起甘薯、瓜果或蔬菜霉烂黑根霉也称匐枝根霉，分布广泛，常出现于生霉的食品上，瓜果蔬菜等在运输和贮 藏中的腐烂及LT薯的软腐都与其有关黑根霉是目前发酵工业上常使用的微生物菌种 黑根霉的最适生长温度约为28°C,超过32°C不再生长根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用的糖化 菌我国是最早利用根霉糖化淀粉(即阿明诺法)牛产酒精的国家根霉能生产延胡索 酸、乳酸等冇机酸，还能产生芳香性的酯类物质根霉亦是传化缶族化合物的重要菌类 与生物技术关系密切的根霉主耍有黑根霉、华根霉和米根霉根霉的菌丝无隔膜、有分枝和假根，营养菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成 特有的假根，从假根处向上丛生直立、不分枝的抱囊梗，顶端膨大形成圆形的抱子囊， 囊内产生抱囊抱子抱子囊内囊轴明显，球形或近球形，囊轴基部与梗相连处有囊托 根霉的他子可以在固体培养基内保存，能长期保持生活力黑根霉也称匐枝根霉，分布广泛，常岀现于生霉的食 品上，瓜果蔬菜等在运输和贮藏小的腐烂及甘薯的软腐都 与其有关黑根霉（ATCC6227b）是目前发酵工业上常使用 的微生物菌种。
黑根霉的最适生长温度约为28°C,超过 32°C不再生长图1-根霉图中1为抱子囊、2为砲囊砲子、3为匍匐枝、4为假根 此外无性生殖时还可以产生接合泡子囊、芽泡子囊原生质体是指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜 所包闌的裸露细胞它是细胞生命的主体，是细胞最主要、也是最重要的部分，细胞的 一切代谢活动都在此进行原生质体融合技术起源于20世纪60年代1974年，匈牙利的 Ferenczy1"采用离心力诱导的方法报道了 口地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从 而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间 的融合（如光合细菌与酵母菌的融合）原生质体融合就是用水解酶除去遗传物质转移 的最大障碍——细胞壁，释放出只有原生质膜包被着的球状原生质休，然后用物理或化 学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的n 的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子原生质体融合与常规杂交相比有 多方面的优势，除了能显著提高重组频率外，还具有定向育种的含义2叽原生质体融合 育种主要步骤如下：（1）原生质体制备；（2）原生质体融合；（3）原生质体或融合 子再生；（4）融合子的筛选。
微生物原生质体融合起源起源于20世纪50年代，由SalTon引入到微生物学中，1953 年Weibull等首次用溶菌酶处理巨大芽孑包杆菌（Boe〃/府megaterium）得到原生质体，并首先 提出原生质体在微生物学中的概念，此后经历了一个逐步改进和完善的过程主耍的原 生质体的融合方法有：NaNCh、高钙高pH值、PEG法等，PEG法是采用聚乙二醇为融合 剂的一种化学方法，使用简便、经济、可重复性强心1常用的根霉原生质体制备1.1材料的一般培养方式根霉、假丝酵母；化学试剂均为分析纯，生物试剂为生物纯；溶菌酶、蜗牛酶（北 京奥博星生物技术有限公司）1.2主要使用到的一起设备数显振荡培养箱BS-2F、显微摄像机Wat-202D.电脑、超净工作台SW・CJ・IB、相 差显微镜OLYMPUS-CH型、低温冰箱三洋3321.3主要使用到的试剂与设备P缓冲液：蔗糖103g, K2SO4 0.25g, MgCl2-6H2O 2.02g,微量元素溶液2mL加水 至800mL,每个250ml三角瓶中装入上述溶液80mL, 121°C灭菌20min；微量元素溶液: ZnCl2 40mg> FeCl3-6H2O 200mg> CaCl2-2H2O 10mg、MnCl24H2O 10mg、Na^B^ lOHaO 10mg、(NH4)6MO7O24-4H2O lOmg 加水溶解定容至 lOOOmL； 10.3%蔗糖溶液：300mL 的 三角瓶中每瓶加入100mL蔗糖溶液，121°C灭菌30min； 2mg/mL溶菌酶溶液；0.1%甘 氨酸溶液；50%聚乙二醇(PEG 4000)。
1.4主要常用培养基马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA) [21oYEME培养基YEPD培养基⑶2实验方法2.1根霉菌体活化取冰箱中冷藏的根霉斜面菌种，接入PDA的斜面培养基上，放入恒温培养箱，30°C 培养2d,在YEME培养基中接入O.lmL霉菌抱子悬浮液于振荡培养箱中摇床培养30°C, 速度200r/min,时间30-40h,在YEME培养基中加入1%甘氨酸，再加入3mL上述摇瓶中 的菌液,摇床培养30°C, 200r/min, 24h⑶2.2根霉原生质体的制备将上述制备的菌丝体悬液镜检后无杂菌污染，全部倒入无菌离心管中，加入10.3% 蔗糖溶液，W3000r/min速度离心7〜10min,弃去上清液，保留菌丝体，加入蔗糖溶液洗 涤菌丝体在离心管中加入4mL溶菌酶溶液，混匀，酶解溶壁过程中将菌液吹吸数次， 并作镜检观察原生质体的溶出溶出后加入5mLP缓冲液，30(k/min离心3min,使残留的 菌丝沉于管底，过滤取上部液体，即为原生质体悬浮液将悬浮液转入新的离心管中， 3000r/min离心7min温和地沉淀原生质休，弃去上清液，加A1 OmLP缓冲液，使原生质体 成奶油状悬液⑹7】。
将原生质体悬液保存T-30°C冰箱中或做下一步融合实验3根霉的形态特征霉菌是形成分枝菌丝的真菌的统称不是分类学的名词，在分类上屈于真菌门的各 个亚门构成霉菌体的基木单位称为菌丝，呈长管状，宽度2〜10微米，可不断自前端 生长并分枝无隔或有隔，一至多个细胞核在固体基质上生长时，部分菌丝深入基质 吸收养料，称为基质菌丝或营养菌丝；向空中伸展的称气生菌丝，可进一步发育为繁殖菌丝，产生砲子大量菌丝交织成绒毛状、絮状或网状等，称为菌丝体菌丝休常呈白 色、褐色、灰色，或呈鲜艳的颜色，有的可产生色素使基质着色霉菌繁殖迅速，常造 成食品、用具大量霉腐变质，但许多有益种类己被广泛应用，是人类实践活动中最早利 用和认识的一类微生物霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形 成分枝繁茂的菌丝体，但乂不象蘑菇那样产生大型的子实体在潮湿温暖的地方，很多 物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌跆显微镜下霉 菌霉菌菌落的特征：A、 形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明， 呈现或松或紧的形状B、 菌落和培养基间的连接紧密，不易挑取，菌 落正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心 的颜色、构造常不一致。
C、 霉菌的菌丝有营养菌丝和气生菌丝的分化， 而气生菌丝没有毛细管水，故它们的菌落必然图2 少根根霉纯培养的镜下形态（乳酸册棉蓝染色）与细菌或酵母菌的不同，较接近放线菌霉菌的菌丝是构成霉菌营养体的基木单位菌丝菌丝是一种管状的细丝，把它放在 显微镜下观察，很像一根透明胶管，它的直径一般为3〜10微米，比细菌和放线菌的细 胞约粗几倍到几十倍菌丝可仲长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫 菌丝体根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成两种类型：无隔膜菌丝和有隔膜菌丝 无隔膜菌丝中无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含冇多个细胞核这是低等真 菌所具有的菌丝类型有隔膜菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌 丝体由很多个细胞组成，每个细胞内有1个或多个细胞核在隔膜上有1至多个小孔， 使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通这是高等真菌所具有的菌丝类型霉菌为适应不同的坏境条件和更有效地摄取营养满足生长发育的需要，许多霉菌的 菌丝可以分化成一些特姝的形态和组织，这种特化的形态称为菌丝变态由专 性寄生霉菌如锈菌、霜霉菌和白粉菌等产生的菌丝变态，它们是从菌丝上产生岀来的旁枝，侵入细胞内分化成根状、指状、球状和佛手状等，用以吸收寄主细胞内的养料。
3.1霉菌的结构组成假根根霉属霉菌的菌丝与营养基质接触处分化出的根状结构，有固着和吸收养料 的功能菌网和菌环某些捕食性霉菌的菌丝变态成环状或网状，用于捕捉其它小生物如线 虫、草履虫等大量菌丝集聚成的紧密组织，是一种休眠体，可抵抗不良的坏境条件其外 层组织坚硬，颜色较深；内层疏松，大多呈白色如药用的茯苓、麦角都是菌核是由大量气生菌丝体特化而成，子实体是指在里面或上面可产生砲子的、 冇一定形状的任何构造例如有三类能产有性砲子的结构复杂的子实体，分别称为闭囊 壳、子囊壳和子囊盘［11J21o3.2霉菌的繁殖特点霉菌有着极强的繁殖能力，而且繁殖方式也是多种多样的虽然霉菌菌丝体上任一 片段在适宜条件下都能发展成新个体，但在自然界中，霉菌主要依靠产生形形色色的无 性或有性他子进行繁殖他子有点像植物的种子，不过数量特别多，特别小霉菌的无性砲子直接由生殖菌丝的分化而形成，常见的有节孑包子、厚垣砲子、砲囊 砲子和分生砲子霉菌的砲子具有小、轻、干、多，以及形态色泽各异、休眠期长和抗 逆性强等特点，每个个休所产生的砲子数，经常是成T上万的，有时竟达儿百亿、儿千 亿甚至更多这些特点有助于霉菌在自然界中随处散播和繁殖。
对人类的实践来说，抱 子的这些特点有利于接种、扩大培养、菌种选育、保藏和鉴定等工作，对人类的不利之 处则是易于造成污染、霉变和易于传播动植物的霉菌病害丽3.3霉菌的菌丝特点由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较人，冇的霉菌的菌丝蔓延，没冇局限 性，其菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性，直径1〜2厘米或更小 菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉 絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落止反面的颜色和边缘与中心的颜色常 不一致z⑸表1菌种的形态特征表现菌种形态特征根霉菌丝无隔，冇匍匐菌丝和假根，假根着生处冇直立的向上他了囊梗，其顶端膨大成也子囊，地子囊底部有半球形囊轴菌丝有隔，气丝分化成分生砲子梗，顶端膨人形成球形顶囊，顶囊表面辐射出状生出一层或两层小梗，小梗上有一串串分住抱子毛霉菌丝无隔、多核、分枝状，无假根或匍匐菌丝，菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孑包囊梗，顶端有球形孑包子囊青霉菌丝有隔，分生抱。