分子生物学技术在中药鉴定中的应用及探讨百度提醒您：此文档己中请保护，版权所有，上传必究我国药材资源丰富，药用动植物约1万余种但目前使用的药材来 源复杂，时有互混、互代、以假充真现 象存在为确保中药使用安全有 效，对各种药材进行准确鉴定显得十分必要传统的中药鉴定手段冇形 态分类、解剖学特征以及理化鉴别等但许多药材亲缘关系较近，外形 类似，或经过加工后己不能辨别出原貌，此时传统的方法己不能满足需 要蛋白电泳法和核酸分析法作为新的分子生物学技术，正逐渐在中药 鉴定工作中得到广泛应用，有人己提岀分子生药学这一新的概念蛋白 电泳法在中草药品种鉴定中应用较早，但其 应用冇局限性因草药中蛋 白含量低，且药用时多为干品，常有蛋白变性现象而核酸作为生命物 质的遗传基 础，用于品种鉴定更为直接、可靠到目前为止，己有多种 动、植物药材用此法进行了鉴定，如蛇类、贝类、西红 花、溪黄草、郁 金、莪术、人参、细辛、姜黄和葛根等1几种常用的核酸分析方法1.1限制性内切酶酶切片段长度多态性分析(RFLP)用1种或1种以上的限制性内切酶处理不同来源中药的DNA样品，将所 产生的片段进行凝胶电泳，然后EB染色，观察它们电泳图谱的差异，或 者离心后转移到硝酸纤维素膜上，用探针进行杂交，再根据杂交区带的 不同來区分。
吴町等应用DNA研吭技术从5种海马 药材中提取DNA,用PCR技术扩增约450bp的12S rRNA基因片段和约490bp的细胞色素b基因片段对扩增产物进行RFLP分析，可以鉴别出2种海马1. 2随机扩增多态性DNA(RAPD)用合成的较短的单个随机引物，以药材总DNA为模板，在DNA聚合酶作用下，进行非 特异性的聚合酶链式反应，分析扩增产物电泳图谱在不同类群中的变异, 扩增片段具冇品种、品系及单株特异性如以往文献认为南、北苍术是 两个不同的种，但后来有人认为它们之间化学成分差异很小，应将北苍 术定为南苍术的变种任冰如等用RAPD技术对南、北苍术不同居群间的 亲缘关系作了鉴定，从DNA水町上证实了南、北苍术亲缘关系很近，差 异很小，为后者的观点提供了有力的证据徐朝晖等在用TCL法不能有效 区分的情况下，成功地用该技术将牛莠子及其5种常易混淆的毛头牛勞、 大翅蓟、水飞蓟、云木香和紫穗槐的果实区分开来1.3高特异性PCR扩增(PCR-RFLP)的特定片段的限制性位点分析使用具冇特异性的引物进行扩增，其扩增产物也具冇 特异性，利用多种不同的限制性内切酶酶解反应产物，构建物理图谱， 分析限制性酶切位点变异在分类群中的发生状况。
王义权等用该法对金 钱白花蛇及其伪品中的Cytb基因片段的序列分析发现，其在真、伪品Z 间的差异远远大于金钱白花蛇种内个体间差异在对Cytb基因序列分析 的基础上，设计了 1对高度特异性的引物，可以100%检出金钱白花 蛇， 并能在混合的药材粉末中检出样品中是否有金钱白花蛇组分，为复方组 分的鉴定提供了一种新手段刘中权等根据22种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA基因片段序列，设计了一对专用于鉴定中药材龟甲原动 物乌龟的鉴 别物,用该对引物扩增乌龟和其它18种龟 共48个样品的12S rRNA模板， 只需一次PCR反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟1.4DNA序列分析对待测样品进行PCR扩增，对 扩增片段测序吴町等对龟的线粒体12SrRNA基因片段进行扩增，然 后测定扩增产物的序列通过这种方法，他们构建了 21种龟类的12S rRNA基因片段序列数据库，成功地将乌龟与其它混淆品种区分开來王 建云等对鸡内金线粒体Cytb进行PCR扩增反应，然后测序，将鸡内金 与鸭内金区分了开来他们还用该法鉴 定了鹿鞭与牛鞭、驴鞭1.5扩增片段长度多态性法(AFLP)该方法是用一人工接头与限制性内切酶的基因组DNA片段连接，制 成AFLP模板DNA,合成一系列3L末端随机改变数个碱基的PCR引物，进行PCR特异条件的扩增，经电泳检测后可得到DNA 指纹图谱。
与RFLP、RAPD比较，AFLP法构建的DNA指纹图谱具有重复 性好、灵 敏度高的优点，展示了 AFLP技术特别适合中药材品种鉴定的 应用价值和广阔前景罗志勇等运用这一技 术，成功地构建出多态性丰 富和重复性好的人参、西洋参DNA指纹图谱，并运用计算机软件对结果 进行二维图象处理，计算出不同样品间的相似度指数，并且从相 似度指 数发现西洋参与引种到我国吉林的西洋参的遗传物质基础一一基因组DNA发生了一定的变异，但变异程度小于人参与西洋参间的差异1.6基因芯片技术基因芯片分析的实质是在面积不大的基片表面上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的 识别分子，结合或反应在相同条件下进行反应结果用同位素法、化学荧 光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记 录通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信 息芯片杂交中固定在芯片上的往往是成千上万的探针而与之杂交的是经过标记(同位素或荧 光)的样品核酸，此靶标样品核酸往往需先经过PCR扩增或克隆或 逆转 录(mRNA),然后打碎成文库芯片分析技术的优点是在一次实验中就可以 同时分析成千个多态性，大大节约了时间和精力，且减少了实验的随机 误差。
但目前应用最多的是在陕学诊断方面，中药基因组的芯片还很少 随着芯片制作技术的提高和对中药基因组的了解的深入，一定会冇更多 的中药DNA芯片上市，用丁•中药品种及品质的研氏2优点传统的鉴定手段更多地是从生物的形态、结构上进行鉴别，而生物 的外形、结构在环境因素的影响下会 发生一定程度的改变例如同种植 物在气候、土壤、水份、日照不同的条件下，其形态、组织细胞都会冇差 异，因而有可能会造成错误的鉴定结果，特别是疑难种、易混种，用传统 方法较难鉴定而DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和生 物体发育阶段及器官组织差异的影响，因而以DNA分子特征进行物种鉴 别准确可靠此外，一些经多道工序加工过的药材以及复方制剂中的药物用传统 的方法难以鉴定，而分子遗传标记 技术则可以轻易地克服这一困难，加以 准确地鉴定3注意的问题3.1污染问题由于分子遗传标记具冇高度的灵敏 性，因而,样品如霉变、虫蛀等都会留下外源的DNA分 子，也会随同鉴定 物的DNA -起被扩增，使结果失真因而在进行鉴定前，应将药材进行 处理，如彻底清洗后 紫外照射30min,以免干扰结果3. 2技术上的问题在PCR扩增技术中，扩增产物应具有重复性，才能用于鉴定研尢。
要解决这…问题，应从反应的模板DNA 浓度、反应体系中Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量以及引物的选择这 几方面进行 反复摸索，找到反应的最佳条件，使反应后的扩增产物 具有 高度重复性此外，由于中药材中所含杂质较多，会冇抑制物存在，使扩 散反应不能进行，这时需纯化处 理或加入BSA以中和抑制PCR反应的物 质还要注意 的是，在鉴定过程中，不应只用1种引物，而应选几种引 物巾丁行进行，这样才能保证实验结果的客观性3. 3价格上的问题分子生物学研宠中材料和试剂 成本较高，一般小的单位较难承受，马小军等人用毛细生物管PCR法大大地节约了材料和试剂他们将PCR扩 增反应放在毛细管中进行/吏样品DNA量、Taq酶量、引物量等大大减少，且反应吋间仅为 普通PCR的1/3,从而使成本有所降低此外，随着分子生物学的发展，产 品规模化生产的形成，分子生物学实验用的一般消 耗品如引物、Taq酶的价格己有较大辐度的下降，且有进一步下降的趋势因此，随着分子遗传标记鉴定研氏的不断深入，完全有可能找到更加经济实用的手段和方法3. 4品种相同,有效成分含量不同之间的矛盾罗志勇在分析人参、西洋参基因DNA指纹图谱吋，发现原 产地西洋参与引 种到我国吉林的西洋参DNA指纹图谱的相似度仅为0.76,说明引种西洋参 的基因组DNA发生了一定程度的变异。
有人发现，植物的产地不同，英 DNA有一定差异，成分也会有变化如蔡金娜等根据1「2建立的系统发 生树，将蛇床的7个样品分为3组，这3组分布于中国不同的纬度，在同一纬 度的蛇床中，其香豆素成分的含量随湿度的变化而不同，提示植物内成 分不仅与种属有关，亦与生长环境有关可见，生长环境的变化，除了 直接导致植物中成分含量的变 化，还有可能导致英基因组DNA也发生变化因而，基 因组DNA也可能反映出植物成分的变化但是，也存在植物基因组DNA没有变化，而成分变化很 大的情况，对此，应结合基因的表达进行研咒，找出基因组DNA序列及 其表达情况与化学型之间的关系，这方面的工作对中药的深入研克大有 帮助分子生物学的许多研完手段、方法己广泛运用于中药研先领域，中 药材的品种鉴定是其中的一个方面，在这方面，工作才刚刚起步，己涉 及的药材和研咒人员还不广泛，目前也只是开展到根据其DNA的不同将 药材区分开来，而与中药化学、中药药理、中药药性、临床研氏方面的 结合还未开展，在这方面要做的工作还很多，前景也很广阔中医药学 作为一门古老的学科，正面临着巨大的挑战，只有抓住机遇，与新科技、 新技术结合，才能有所突破相信分子生物学与中医药的结合 实际，一定 能使中医药的研吭向前迈出一大步。