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1、基因工程制药基因工程制药基因工程药物基因工程药物: : 利用基因工程技术生产人体健康所需的、难以用传统方法制取的蛋白质、多肽和基因等药物。 基因工程药物包括基因工程药物包括: : 基因工程治疗药物，基因工程抗体和疫苗，基因治疗药物，基因工程诊断试剂等。基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程获获得得目目的的基基因因目目的的基基因因克克隆隆构构建建重重组组表表达达载载体体构构建建、筛筛选选基基因因工工程程细细胞胞工工程程细细胞胞培培养养表表达达产产物物的的分分离离、纯纯化化除除菌菌过过滤滤半半成成品检定品检定成品检定成品检定包装。包装。目的基因的获得目的基因的获得从基因组中获得从基因
2、组中获得从基因组文库中获得从基因组文库中获得从从cDNAcDNA文库中获得文库中获得PCRPCR扩增法扩增法从化学合成方法中获得从化学合成方法中获得免疫法分离目的基因免疫法分离目的基因mRNA选择宿主细胞的原则选择宿主细胞的原则安全性高、便于导入重组安全性高、便于导入重组DNADNA、便于、便于筛选克隆子、重组子能在细胞内稳筛选克隆子、重组子能在细胞内稳定维持、不影响外源基因高效表达、定维持、不影响外源基因高效表达、具有较好的翻译后加工系统、遗传具有较好的翻译后加工系统、遗传密码无特别的偏倚性、遗传性稳定，密码无特别的偏倚性、遗传性稳定，易于扩大培养、有较高的应用价值。易于扩大培养、有较高的应
3、用价值。外源基因表达常用的宿主细胞外源基因表达常用的宿主细胞大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统优优点点：遗遗传传背背景景、代代谢谢途途径径和和表表达达机机制制清清楚楚；易易于于遗遗传传学学操操作作；生生长长迅迅速速；异异源源蛋蛋白白的的高高效效表达表达; ;也可以分泌型表达也可以分泌型表达 缺缺点点：潜潜在在致致热热源源；蛋蛋白白质质不不分分泌泌到到培培养养基基中中；无翻译后修饰系统；异源蛋白而易形成包函体无翻译后修饰系统；异源蛋白而易形成包函体外源基因表达常用的宿主细胞外源基因表达常用的宿主细胞枯草芽孢杆菌表达系统枯草芽孢杆菌表达系统优点：不产生内毒素；良好的分泌型；优点：不产生内毒素；良好的
4、分泌型；天然构象的可能性大。天然构象的可能性大。缺缺点点：外外源源蛋蛋白白表表达达量量较较低低；细细胞胞内内外高水平的蛋白酶。外高水平的蛋白酶。外源基因表达常用的宿主细胞外源基因表达常用的宿主细胞酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统优优点点：简简单单的的真真核核生生物物，不不产产生生病病毒毒，内内毒毒素素；遗传背景清楚；有翻译后修饰；分泌异源蛋白。遗传背景清楚；有翻译后修饰；分泌异源蛋白。缺缺点点：异异源源蛋蛋白白表表达达量量低低；有有超超糖糖基基化化趋趋势势；异异源源蛋蛋白白有有时时分分泌泌不不理理想想，30Kd30Kd不不分分泌泌，乙乙醇积累导致异源蛋白合成不足。醇积累导致异源蛋白合成不足。外
5、源基因表达常用的宿主细胞外源基因表达常用的宿主细胞动物细胞表达系统动物细胞表达系统 CHO CHO、COSCOS、3T33T3优优点点：可可分分泌泌异异源源蛋蛋白白；正正确确的的糖糖基基化和翻译后修饰化和翻译后修饰缺缺点点：异异源源蛋蛋白白表表达达量量低低；难难以以大大规规模模生生产产；培培养养基基昂昂贵贵；培培养养时时间间长长；培养条件苛刻培养条件苛刻重组重组DNA转化宿主细胞的途径转化宿主细胞的途径 直接转化法、化合物诱导法、直接转化法、化合物诱导法、接合转化法、噬菌体转染法、电接合转化法、噬菌体转染法、电穿孔转化法、基因枪轰击法、超穿孔转化法、基因枪轰击法、超声转化法、脂质体介导转化法、
6、声转化法、脂质体介导转化法、磷酸钙转化法等。磷酸钙转化法等。重组子的鉴定重组子的鉴定1. 根据重组子的特征鉴定根据重组子的特征鉴定DNADNA分子的大小、酶切图谱、分子的大小、酶切图谱、PCRPCR扩扩增片断、增片断、DNADNA杂交法、杂交法、DNADNA测序测序2. 2. 根据转录产物鉴定根据转录产物鉴定NorthernNorthern、RT-PCRRT-PCR3. 3. 根据翻译产物鉴定根据翻译产物鉴定蛋白电泳、蛋白电泳、ELISAELISA、WesthernWesthern、RIARIA异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达包涵体型表达包涵体形成的机理
7、：包涵体形成的机理：外原基因的表达产率过高。外原基因的表达产率过高。无真核细胞的亚细胞器结构和稳定因子无真核细胞的亚细胞器结构和稳定因子宿主细胞的异源蛋白。宿主细胞的异源蛋白。所处的环境不利于折叠。所处的环境不利于折叠。高浓度异原蛋白造成高浓度的微环境。高浓度异原蛋白造成高浓度的微环境。异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达包涵体型表达包涵体包涵体-生物大分子致密地聚集在细胞內，生物大分子致密地聚集在细胞內，形成的高密度、不溶性的无膜的颗粒结构。形成的高密度、不溶性的无膜的颗粒结构。包涵体的性质包涵体的性质-主要是表达的外原蛋白，其主要是表达的外原蛋白，其高级
8、结构往往是错误的。只有在变性剂中才高级结构往往是错误的。只有在变性剂中才能溶解。要获得具有生物学活性的蛋白质必能溶解。要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的错误折叠蛋须将包涵体溶解，释放出其中的错误折叠蛋白质，将各个次级键打开，在体外进行蛋白白质，将各个次级键打开，在体外进行蛋白质的重折叠。质的重折叠。异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达的优缺点包涵体型表达的优缺点优点：优点：外外原原基基因因的的表表达达量量极极高高，对对宿宿主主细细胞胞的的生生长和代谢影响小长和代谢影响小抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强目标蛋
9、白的纯度高，易于分离和纯化目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化缺点：缺点：必须必须复性复性异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式分泌型分泌型表达表达分泌型表达的特点：分泌型表达的特点： 在在N N端端加加上上能能够够跨跨膜膜的的信信号号肽肽序序列列。这这对对重重组组蛋蛋白白的的折折叠叠可可能能有有一一定定好好处处；由由于于跨跨膜膜是是逐逐个个进进行行的的，蛋蛋白白间间的的交交联联机机会会较较少少；周周质质中中的的蛋蛋白白酶酶活活性性比比胞胞质质低低；周周质质蛋蛋白白仅仅占占菌菌体体总总蛋蛋白白的的4%4%，使使之之易易于于纯纯化化。但但分分泌泌到到周周质质中中的的重重组组蛋蛋
10、白白其其构构象象不不一一定定是是天天然然构构象象，在在周周质质中中的重组蛋白也可能形成包涵体。的重组蛋白也可能形成包涵体。异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式分泌型分泌型表达表达分泌型表达的优缺点分泌型表达的优缺点优点优点-1 -1 可溶性表达可溶性表达 2 2 可能接近天然构象可能接近天然构象 3 Met 3 Met可被切除可被切除缺点缺点-1 -1 表达量低表达量低 2 2 纯化较困难纯化较困难 3 3 面临复性问题面临复性问题异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式融合型融合型表达表达融合型表达的特点：融合型表达的特点： 将将高高量量表表达达的
11、的宿宿主主蛋蛋白白基基因因与与外外源源基基因因拼拼接接在在一一起起，大大量量表表达达内内、外外原原杂杂合合蛋蛋白白。在在融融合合蛋蛋白白中中，外外源源表表达达产产物物能能在在菌菌体体蛋蛋白白的的引引导导下下形形成成较较好好的的杂杂合合折折叠叠构构象象，封封闭闭了了部部分分重重组组蛋蛋白白上上的的酶酶切切敏敏感感位位点点，增增加加了了抗抗酶酶解解能力。能力。异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 融合型融合型表达表达融合型表达的优缺点：融合型表达的优缺点：优点优点- 1稳定性强稳定性强 2比单纯分泌表达产量高比单纯分泌表达产量高 缺缺点点-1需需将将融融合合蛋蛋白白两两者者
12、分分开开，对对酶切试剂和工艺的要求高酶切试剂和工艺的要求高 2可能面临体外复性问题可能面临体外复性问题 异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式融合型融合型表达表达融合型表达系统的构建原则：融合型表达系统的构建原则： 选选择择能能够够高高效效表表达达的的宿宿主主结结构构基基因因， 尽尽量量避避免免融融合合蛋蛋白白中中两两者者的的理理化化性性质质过过于于接近，以利于异原蛋白的分离。接近，以利于异原蛋白的分离。 两两种种蛋蛋白白之之间间留留有有特特定定的的分分割割位位点点，能够准确分离。能够准确分离。切割融合型蛋白的条件切割融合型蛋白的条件蛋白内切酶的纯度一定要高蛋白内切酶的纯
13、度一定要高选用断裂位点专一性最强的酶选用断裂位点专一性最强的酶目的蛋白内部不存在同样的切割位目的蛋白内部不存在同样的切割位点点严格按照相应酶切的最佳条件进行严格按照相应酶切的最佳条件进行几种常用的融合蛋白表达载体几种常用的融合蛋白表达载体Protein A (葡萄球菌葡萄球菌A蛋白蛋白) GST（谷光甘肽谷光甘肽S-转移酶）转移酶） CBD (几丁质结合功能区几丁质结合功能区) (纤维素结合功能区纤维素结合功能区)MBP (麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白)硫氧还原蛋白硫氧还原蛋白周质酶片断周质酶片断异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式寡聚型表达寡聚型表达寡聚型表达的特点：
14、寡聚型表达的特点： 单单纯纯增增加加载载体体数数量量，在在一一定定程程度度上上可可提提高高表表达达量量。然然而而受受体体细细胞胞的的大大部部分分能能源源除除了了表表达达目目的的基基因因外外，还还要要表表达达载载体体上上更更多多的的，有有些些是是已已无无关关紧紧要要的的产产物物。因因此此单单纯纯增增加加质质粒粒拷拷贝贝数数有有时时表表达达量量也也上上不不去去。这这时时可可考考虑虑采采用用将将一一连连串串外外源源基基因因克克隆隆在在相相对对低低拷拷贝贝的的质质粒粒上上形形成成寡寡聚聚型型表表达达，虽虽拷拷贝贝数数少少但但转转录录产产物物并并不不少少，在一定程度上节省了资源。在一定程度上节省了资源。
15、多表达单元重组多表达单元重组目的基因目的基因转录转录翻译翻译多顺反子重组多顺反子重组转录转录 翻译翻译SDSDSDSDSDSD外源基因外源基因多编码序列从组多编码序列从组转录转录翻译翻译体外切割体外切割外源基因外源基因异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式整合型表达整合型表达整合型表达的特点：整合型表达的特点： 将将外外源源基基因因直直接接整整合合在在宿宿主主细细胞胞的的染染色色体体上上，大大大大增增加加了了外外源源基基因因的的稳稳定定性性，并并免免去去了了对对宿宿主主细细胞胞的的抗抗性性选选择择。最最好好整整合合到到不不干干扰扰宿宿主主细细胞胞正正常常生生理理代代谢谢的
16、的非非编编码码区区中中的特定位置。的特定位置。外源基因染色体定位整合原理外源基因染色体定位整合原理 根据根据DNADNA同源交换原理，在外源同源交换原理，在外源基因两侧各组合一段与染色体特定基因两侧各组合一段与染色体特定部位完全相同的同源序列。外源基部位完全相同的同源序列。外源基因越长同源序列也需越长。因越长同源序列也需越长。外源基因在大肠杆菌外源基因在大肠杆菌中的高效表达的方法中的高效表达的方法强化异源蛋白质的生物合成强化异源蛋白质的生物合成抑制异源蛋白质的降解抑制异源蛋白质的降解优化菌体培养和诱导表达的条件优化菌体培养和诱导表达的条件强化异源蛋白质的生物合成强化异源蛋白质的生物合成 提高外源基因的剂量提高外源基因的剂量优化转录调控元件优化转录调控元件优化翻译元件优化翻译元件提高外源基因的剂量提高外源基因的剂量1. 1. 合理采用高拷贝质粒合理采用高拷贝质粒 质质粒粒扩扩增增多多发发生生在在宿宿主主细细胞胞生生理理代代谢谢最最旺旺盛盛的的对对数数生生长长期期内内，过过早早的的质质粒粒快快速速扩扩增增会会影影响响宿宿主主的的生生长长与与代代谢谢，进进而而导导致致质质粒粒的的不不稳稳定定
