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1、细菌内毒素检查法新乡市食品药品药品检验所第一页，共八十五页。（优选）细菌内毒素检查法讲义新乡市食品药品药品检验所第二页，共八十五页。一、简况一、简况 一一百百多多年年前前，在在西西方方医医学学发发展展史史上上，一一个个最最重重要要的的发发展展就就是是注注射射给给药药（特特别别是是静静脉脉注注射射）方方式式的的创创立立。毫毫无无疑疑问问它它在在人人类类与与疾疾病病作作斗斗争争的的过过程程中中起起了了重重要要作作用用，但但是是无无论论过过去去还还是是现现在在，临临床床上上使使用用注注射射剂剂时时经经常常出出现现注注射射引引起起的的发发热热、头头痛痛、恶恶心心、肤肤色色灰灰白白、昏昏迷迷等等，甚甚至
2、至导导致致患患者者死死亡亡，这这些些反反应应总总称称为为不不良良反反应应。不不良良反反应应可可分分为为热热原原反反应应和和过过敏敏反反应应。因因此此，注注射射剂剂的的热热原原检检查查是保证药品安全的重要检验项目之一。是保证药品安全的重要检验项目之一。第三页，共八十五页。 1912 1912年第一次考虑用家兔做热原试验，年第一次考虑用家兔做热原试验，19421942年美国首先将家兔热原检查方法收入药典。中国年美国首先将家兔热原检查方法收入药典。中国药典于药典于19531953年开始收载。因此，半个世纪以来，年开始收载。因此，半个世纪以来，家兔法对保证药品临床使用的安全发挥了重要的家兔法对保证药品
3、临床使用的安全发挥了重要的作用。但是，随着科学技术和制药工业的发展，作用。但是，随着科学技术和制药工业的发展，这一检查法的局限性越来越明显，所以用新的检这一检查法的局限性越来越明显，所以用新的检验方法代替家兔法检测热原早已成为国内外医药验方法代替家兔法检测热原早已成为国内外医药界科研、生产、临床检验等部门很紧迫的问题，界科研、生产、临床检验等部门很紧迫的问题，基于科学实践发展的要求从而发现并建立了细菌基于科学实践发展的要求从而发现并建立了细菌内毒素检查方法。内毒素检查方法。第四页，共八十五页。 细菌内毒素试验方法有：细菌内毒素试验方法有： 凝胶法（凝胶法（Gelation assayGelat
4、ion assay）属限量；属限量； 浊度法（浊度法（Turbidimetrec assayTurbidimetrec assay）属定量；属定量； 显色底物法（显色底物法（Chromogenic assayChromogenic assay）属定量法；属定量法； 免疫方法（免疫方法（Immumology assayImmumology assay）等。等。第五页，共八十五页。历史回顾和发展趋势历史回顾和发展趋势1、历史回顾历史回顾 美国是发明鲎试剂和最先建立鲎试验方法的国家。美国是发明鲎试剂和最先建立鲎试验方法的国家。 19561956年年，美美国国动动物物学学家家F.BangF.Bang发
5、发表表论论文文鲎鲎的的一一种种细细菌菌性性疾疾病，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。病，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。 1964 1964年，年，F.BangF.Bang和和J.levinJ.levin提出了鲎血凝集的初步机理。提出了鲎血凝集的初步机理。 1968 1968年，年，F.BangF.Bang和和J.levinJ.levin建立了鲎试验的方法。建立了鲎试验的方法。 19731973年年，美美国国食食品品药药物物管管理理局局（FDAFDA）承承认认鲎鲎试试剂剂为为一种生物制品。一种生物制品。第六页，共八十五页。 19801980年年，FDAFDA制制定定了了用用鲎鲎试试剂剂检检查
6、查人人用用和和兽兽用用注注射射药药内内毒毒素素的的准准则则；美美国国药药典典2020版版（USPXXUSPXX）收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法（BETBET），但但在在药药典典各各品品种正文中未涉及。种正文中未涉及。 19831983年年，USPXXUSPXX版版第第四四增增补补本本规规定定了了注注射射用用水水等等5 5种种常常用用药药品品和和4040种种放放射射性性药药品品用用细细菌菌内内毒毒素素检检查取代热原检查。查取代热原检查。 19911991年年，USPXXUSPXX版版第第五五增增补补本本规规定定185185种种药药品以细菌内毒素检查取代热原检查。品以细菌内毒素检查取代热
7、原检查。第七页，共八十五页。19951995年年，USPXXUSPXX版版规规定定471471种种药药品品用用细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法检检查查，保保留留热热原原检检查查的的药药品品不不足足3030种。种。 19991999年年，USPXXUSPXX版版规规定定670670种种药药品品用用细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法检检查查，保保留留热热原原检检查查的的药药品品约约2020种。种。 20002000年年，国国际际调调和和委委员员会会使使美美国国药药典典（USPUSP）、欧欧洲洲药药典典（EPEP）和和日日本本药药局局方方（JPJP）达达成成BETBET的的国国际际调调和和案案，统统一
8、一的的BETBET已已收收载载于于USPXXUSPXX和和NF19NF19的第二增补本中，并于的第二增补本中，并于20012001年年1 1月月1 1日生效。日生效。第八页，共八十五页。 英英国国、欧欧洲洲药药典典以以及及日日本本药药局局方方都都已已收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法，但但规规定定检检查查的的品品种种各各有有不不同同。一一个个共共同同的的特点是注射水是最先被允许检查的品种。特点是注射水是最先被允许检查的品种。 中国目前是世界上鲎试剂产量最大的国家之一。中国目前是世界上鲎试剂产量最大的国家之一。 1975 197519821982年是我国鲎试剂的研制阶段，当年是我国鲎试剂的
9、研制阶段，当时由于缺乏标准化研究的基础，上千批次的实验时由于缺乏标准化研究的基础，上千批次的实验结果难于分析。结果难于分析。第九页，共八十五页。19831983年，卫生部授权国家药品生物制品检定所组年，卫生部授权国家药品生物制品检定所组织全国范围的大输液及放射性药品鲎试验的协作研究。织全国范围的大输液及放射性药品鲎试验的协作研究。 19881988年年，卫卫生生部部颁颁布布细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法，允允许许4 4种药品使用细菌内毒素检查法初检。种药品使用细菌内毒素检查法初检。 19931993年年，中中国国药药典典19901990年年版版第第二二增增补补本本收收载载细细菌菌内毒素检查法
10、，但未涉及任何品种正文。内毒素检查法，但未涉及任何品种正文。19951995年年，“中中国国药药典典细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法实实施施会会议议纪纪要要”提提出出争争取取在在3 35 5内内我我国国上上百百种种药药品品由由热热原原检检查查法法改改为细菌内毒素检查法。为细菌内毒素检查法。第十页，共八十五页。 19961996年年，中中国国药药典典19951995年年版版二二部部附附录录收收载载经经修修订订的的细细菌菌内内的的毒毒素素检检查查法法，注注射射用用水水等等五五种种常常用用药药品品和和九九种种放放射射性性药药品品正正文文规规定定了了细细菌菌内内毒毒素素检检查查，取取消消了了热热原原检
11、检查查（其其中中5%5%及及10%10%葡葡萄萄糖糖注注射射液液是是后后来来发发通通知补充）。知补充）。 19981998年年，中中国国药药典典19951995年年版版19981998年年增增补补本本收收载载经经重重大大修修订订的的细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法，其其中中对对鲎鲎试试剂剂和和细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水的的质质量量以以及及细细菌菌内内毒毒素素检检查查方方法提出了更高要求。法提出了更高要求。 第十一页，共八十五页。 20002000年年，中中国国药药典典20002000年年版版（二二部部）新新增增细细菌菌内内毒毒素素检检查查品品种种5757种种，且且收收载载了了细菌内毒
12、素检查法应用指导原则。细菌内毒素检查法应用指导原则。2002005 5年，中国药典年，中国药典2002005 5年版（二部）年版（二部）新增细菌内毒素检查品种约新增细菌内毒素检查品种约200200种。种。第十二页，共八十五页。2 2、发展趋势、发展趋势 A.A.各国药典收载细菌内毒素检查法成为发展的趋势各国药典收载细菌内毒素检查法成为发展的趋势 细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为官方承细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为官方承认的一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技认的一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量术
13、水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着时间的推移，必将有更多国家的药典收载细的提高。随着时间的推移，必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。菌内毒素检查法。第十三页，共八十五页。B.细菌内毒素检查取代热原检查成为必然的趋势细菌内毒素检查取代热原检查成为必然的趋势 细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法所所具具有有的的优优点点表表明明它它比比热热原原检检查查法法更更适适应应现现代代制制药药工工业业的的发发展展。从从USPXXUSPXX版版开开始始收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法，到到USPXXUSPXX版版已已有有超超过过90%90%的的注注射射剂剂品品种种规规定定内内
14、毒毒素素检检查查。其其它它国国家家的的药药典典规规定定细细菌菌内内毒毒素素检检查查的的品品种种同同样样经经历历了了从从无无到到有有，从从少少到到多多的的过过程程。可可以以预预见见，细细菌菌内内毒毒素素检检查查最最终终必必然然会会取取代代绝大多数注射剂品种的热原检查。绝大多数注射剂品种的热原检查。 第十四页，共八十五页。C.C.走向统一的细菌内毒素检查法走向统一的细菌内毒素检查法 USPUSP、EPEP和和JPJP是是三三个个收收载载细细菌菌内内毒毒素素检检查查法法（BETBET）较较早早的的药药典典，它它们们分分别别建建立立了了各各自自的的内内毒毒素素标标准准物物和和BETBET，WHOWHO
15、为为了了保保持持内内毒毒素素的的国国际际标标准准品品（ISIS）的的效效价价（IUIU）与与各各国国内内毒毒素素标标准准品品的的效效价价（EUEU）的的一一致致性性，进进行行了了内内毒毒素素ISIS国国际际协协作作研研究究，自自此此，内内毒毒素素的的标标准准在在IUIU与与EUEU之之间间实实现现了了统统一一，即即1 1IU=1EUIU=1EU。虽虽然然内内毒毒素素标标准准初初步步实实行行了了统统一一，但但在在不不同同的的药药典典方方法法下下测测定定的的内内毒毒素素值值仍仍有有差别。差别。第十五页，共八十五页。细菌内毒素细菌内毒素 细菌内毒素是细菌毒素的一类，细菌内毒素是细菌毒素的一类，是革兰
16、氏阴性菌细胞壁是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（）和微量蛋白（Protein）的）的复合物，它不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡并解体复合物，它不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡并解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁中，其化学成份主要是由体、螺旋体等）的细胞壁中，其化学成份主要是由O-特异性链、特异性链、核心多糖、类脂核心多糖、类脂A三部分组成。三部分组成。第十六页，共八十五页。l类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。所以，类脂A（Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构
