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1、绿脓杆菌检验技术第一页，共二十四页。目的：1.了解化妆品中铜绿假单胞菌检测的基本过程。2.掌握几种培养基的配置方法。3.掌握铜绿假单胞菌的鉴定及生化特征。原理： 铜绿假单胞菌为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，在普通培养基上生长良好，菌落大小不一，平均直径2mm3mm，扁平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态。氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，此外还能液化明胶，还原硝酸盐产生氮气，在42条件下可以生长，可与类似菌区别。第二页，共二十四页。操作步骤 检样前化妆品的处理 接样于营养肉汤增菌，37，12h，140rpm培养分离培养，挑取培养物接于十六烷基三甲基溴化铵平 板， 37，18-24h 染色镜检
2、 配十六烷基三甲基溴化铵培养基（选择性培养基，大肠杆菌不能生长，革兰氏阳性菌生长完全受到抑制） 配绿脓菌素测定用培养基，明胶培养基，硝酸盐蛋白胨水培养基，普通琼脂斜面培养基第三页，共二十四页。操作步骤 特征性检验氧化酶 绿脓菌素 硝酸盐还原 明胶液化 42 生长 试验 试验 产气试验 试验 试验取菌+ 1滴 接菌，37 接菌 接菌 接菌二甲基对 24h +氯仿 37 24h 37 24h 42 24h 苯二胺 移出+盐酸紫红色（+） 紫红色（+） 有气体（+） 溶解成液状（+） 生长（+） 不变色（-） 不变色（-） 无气体（-） 未溶解（-） 不生长（-） 第四页，共二十四页。实验一 培养基
3、的制备及细菌的分离培养第五页，共二十四页。实验目的掌握培养基制备的原理和方法掌握细菌的分离培养了解灭菌方法第六页，共二十四页。实验原理 不同的微生物生长繁殖都需要提供一定的营养条件，在实验室中，微生物的营养是由培养基来提供的。培养基是按照微生物生长繁殖所需要的营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。 除营养条件以外，微生物必须在最适酸碱度范围内才表现出最大生命力，因此，应针对不同的微生物将培养基的pH值调节到适当范围。 第七页，共二十四页。操作步骤按培养基按培养基配方称量配方称量加水加加水加热熔化热熔化调节调节pH值值分装分装包装包装灭菌灭菌备用备用第八页，共二十四页。操作步骤 1.绿脓菌素测
4、定用培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 制成斜面2.明胶培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 直立制成高层3.硝酸盐蛋白胨水培养基300ml 加热溶解 调pH 分装有小倒管的试管 高压 直立制成高层4.普通琼脂斜面培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 制成斜面第九页，共二十四页。注意事项1.培养基溶解时，加有琼脂的培养基易沸，应注意看守。2.注意调节培养基的pH。3.称牛肉膏用玻片，称甘油用小烧杯。4.加热后应补足液量。5.注意做好标记。第十页，共二十四页。细菌的分离培养原理： 通过划线，将混杂的细菌在平板表面逐一分散，经培养后，各自形成菌落(col
5、ony)。根据菌落形态、特征挑选单个菌落，移种培养后，即得到纯种细菌。第十一页，共二十四页。方法：平板划线法有几种，可根据不同情况选用其中一种。 (1)平行划线法 此法适用于含菌不多的液体标本，如脑脊液(CSF)、腹水、分泌物、脓汁以及稀薄的菌液等。左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本，先在平板的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线，约占平板面积的一半。将平板转180角，从平板另一端开始也划密集的平行线，直到划满平板的剩余部分。 将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将平板倒置，37培养。第十二页，共二十四页。(2)分区划线法。此法适用于含菌多的检测
6、标本，如粪便，喀痰、细菌固体培养物等。划线前的操作同平行划线法。先在平板的一端将标本涂开并在平板的1/51/4面积上划密集的平行线，接种环火焰灭菌。将平板转约70角，待接种环冷却后，使接种环通过已划线的1区57次，以后即不与1区接触作连续密集划线，约占平板面积的1/4，接种环再通过火焰灭菌。再转平板约70，如上法在第3区划线，此后接种环不再灭菌。重复上述操作在第4区划线，划满余下的培养基表面。将平板底放入盖内，接种环灭菌后放下，置37培养。第十三页，共二十四页。实验二 染色镜检及五项指标试验第十四页，共二十四页。革兰氏染色方法 涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色镜检镜检1 1涂片：取一洁净的载玻
7、片，用记号笔在载玻片做好标记，并在涂片：取一洁净的载玻片，用记号笔在载玻片做好标记，并在载玻片中间滴一小滴生理载玻片中间滴一小滴生理.盐水，以无菌接种环挑取少量菌体盐水，以无菌接种环挑取少量菌体涂片，玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。涂片，玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。2 2干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，
8、也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。3 3固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。在染色或水洗过程中被冲掉。 第十五页，共二十四页。4 4染色：染色： 初染初染: :将结晶紫染液加于涂膜上，将结晶紫染液加于涂膜上，1min1min。 媒染媒染: :水洗后加芦戈氏碘液处理，水洗后加芦戈氏碘液处理，1min1min。 脱色：水洗后用脱色：水洗
9、后用9595乙醇脱色，并摇动玻片，直至流下的液体无色为乙醇脱色，并摇动玻片，直至流下的液体无色为止，约需止，约需0.5min0.5min。 复染：水洗后加石炭酸复红稀释液染色，复染：水洗后加石炭酸复红稀释液染色，1min1min。 水洗，用滤纸吸干，待标本充分干燥后进行镜检。水洗，用滤纸吸干，待标本充分干燥后进行镜检。5 5镜检：镜检：干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（色的是革兰氏阳性菌（G+G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-G-）。以分散开的细菌的革兰氏
10、染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 第十六页，共二十四页。注意事项：酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。菌要少，涂片薄而
11、均匀为好。被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h1824h之内。之内。 第十七页，共二十四页。革兰氏染色方法操作步骤涂片生生理理盐盐水水接接种种环环草酸铵结晶紫 碘 液95%乙醇自然干燥媒染1min脱色0.5min固定初染初染1min复染1min干燥镜检 复红第十八页，共二十四页。铜绿假单胞菌镜下形态图示：第十九页，共二十四页。氧化酶试验原理：有
12、氧呼吸过程中，氧化酵素（oxidase）于电子传送系统扮演一重要角色，其可藉氧分子将已还原之细胞色素（reducedcytochrome）氧化，产生水或过氧化氢。好氧菌与部份兼性厌氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本实验有助于区分奈瑟氏菌属（Neisseria）、假单胞杆菌属（Pseudomonas）此二属为氧化酵素阳性(oxidasepositive)，与肠道杆菌科（Enterobacteriaceae）此科之细菌为氧化酵素阴性（oxidasenegative）。方法： 白色滤纸片 取菌+1滴1% 二甲基对苯二胺 1530s 变红色（+） 不变色（-）第二十页，共二十四页。实验三 结果观察及
13、报告第二十一页，共二十四页。绿脓菌素实验：23个可疑菌落绿脓菌素培养基37 24h 35mL氯仿振荡 提取液呈蓝色取液体于一新试管+1mL1mol/L盐酸 上层盐酸内变为红色为阳性，不变色则为阴性。硝酸盐还原产气实验：可疑菌落硝酸盐蛋白胨水 37 24h 小倒管内有气体产生为阳性，否则阴性。第二十二页，共二十四页。明胶液化实验：可疑菌落穿刺接种于明胶培养基 37 24h 取出放冰箱1030min 呈溶解状为阳性，不溶解则为阴性。42生长实验 ：可疑菌落普通琼脂斜面42 24h铜绿假单胞菌生长，而近似的荧光假单胞菌不能生长 。第二十三页，共二十四页。结果判断 氧化酶（+）绿脓菌素（+） 可报告检出 典型或可疑菌落 氧化酶（+）绿脓菌素（-） 明胶液化（+） 可报告检出 硝酸产气（+） 42 生长（+）第二十四页，共二十四页。
