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1、HIV实验室指南全解及实验室建设指南 人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)及其相关标志的检测是预防HIV感染和艾滋病临床治疗中重要的环节，在艾滋病的防治工作中具有重要作用，如艾滋病的诊断、HIV感染的诊断、血源及器官供体的筛选、流行病学调查、艾滋病病人及HIV感染者的病情动态观察、临床治疗疗效考核以及HIV疫苗的安全性和效果鉴定等。HIV感染标志分为病毒标志、免疫标志和相关标志三大类。病毒标志是指直接从HIV感染者体内分离出病毒或检出HIV组成成分(抗原或核酸)。免疫标志是指HIV感染所产生的HIV抗原、抗体等免疫物质。相关标志是指HIV感染后与艾滋
2、病病情进展有密切关系的某些标志，如CD4细胞、CD8细胞，2微球蛋白、有关细胞因子等。这些标志的测定可为HIV感染及临床疗效的考核提供极为重要的诊断、治疗和预后指征。目前HIV抗体的检测是艾滋病实验室检测中最常用的方法，因为HIV抗体是患者感染HIV后最容易检出并且持续时间最长的免疫学标志，而且抗体的检测方法大多简便、经济，易于推广应用。在介绍各种HIV实验室诊断方法之前，为了使实验室工作人员能够有效地确保结果准确、可靠、优质，我们必须对作为一种感染因子的HIV以及由它所导致的致命性危害有基本的认识。实验室工作人员应特别注意病毒的结构、抗原组成，人体的免疫反应，诊断试验的基本原理、试验结果的解
3、释，以及为了准确而有效地提供实验诊断所必需的质量保证措施。如果由于缺乏技术专长或基本知识而造成不正确的试验结果是不可原谅的。现将有关内容扼要介绍如下：一、人类免疫缺陷病毒(HIV)概述：（一）艾滋病病原体的发现和命名：(二)HIV病毒的形态结构、分类和分型HIV病毒是带有包膜的RNA逆转录病毒，在分类上属于逆转录病毒科中的慢病毒亚科。目前发现有HIV-1和HIV-2两型。现已将HIV-1分为M组，共10个亚型(A-J)和O组，HIV-2也至少有6个亚型（A-F）。在我国流行的是HIV-1，检测到的亚型有8种之多，其中B亚型几乎见于我国各个地区，而C亚型主要见于我国西南和西北地区，E亚型则多见于
4、东南沿海和西南边境地区。HIV病毒呈球形或卵圆形颗粒，直径100-140mm，具有包膜。包膜是在病毒出芽释放过程中获得的。从脂质膜上延伸出来的刺和园头是糖蛋白(gp)。病毒颗粒内部为核心，具有蛋白质衣壳，里面有两个相同拷贝的核酸(RNA)和病毒的三种酶：逆转录酶(RT)、整合酶和蛋白酶。HIV基因组(RNA)含有9个基因，可分为结构基因和调节基因。结构基因包括gag、pol和env3个，皆为调节基因。(三)与诊断技术密切相关的HIV抗原由三个结构基因编码的HIV-1抗原如下：1、gag蛋白：位于病毒颗粒内核心部位，主要有分子量为55000道尔顿的蛋白质(P)，称P55。P55抗原是前体蛋白，在
5、感染过程的早期产生，尔后裂解成其他核蛋白，包括P24、P17和P15等。2、env(包膜)糖蛋白：包膜抗原皆为糖蛋白(gp)，根据分子量分别称为gp160、gp120和gp41。gp160是前体蛋白，是在感染过程中产生的一种成份，随后裂解成gp120和gp41。gp120是外膜蛋白，组成外膜的72个刺突和园头。gp41为跨膜蛋白。二者共同参与病毒与突主细胞CD4分子的粘附。3、pol(聚合酶)蛋白质：包括P66(RT)、P51和P31(整合酶或核酸内切酶)。尽管HIV-1和HIV-2抗原之间有交叉，但它们也有各自的特异性抗原。大多数交叉反应是由抗核心抗原的抗体所致，因为这二种不同病毒的gag抗
6、原是非常保守的。各自的这些特异性抗原在HIV-1和HIV-2是相似的，但分子量可略有不同。例如，HIV-2的跨膜蛋白抗原称为gp36，而某些人则称之为gp41，又如主要的核心抗原为P24，但在HIV-2又称P26。(四)HIV感染的生物学和免疫应答：人体能对HIV的侵入产生抗体应答，通常是在HIV感染2-10周内机体产生抗体。但也有极少数人感染数月乃至数年后仍测不出抗体，故阴性结果并不说明受检者绝无感染。绝大多数人在感染过程中都会对各种病毒抗原成份产生免疫应答，抗体滴度可高达1：50000，但也可以很低。感染早期（血清阳转时）及病程后期（免疫缺陷）时，抗体滴度均较低。大多数病毒感染者都有IgM
7、抗体产生，但HIV感染者中似乎不完全有IgM应答。对于有IgM抗体应答者，在窗口期检出IgM抗体是有益的。HIV基因组可整合到宿主细胞DNA上使机体终身带有病毒，但机体可能很多年不出现症状，成为HIV无症状感染者，只是查血时发现抗HIV阳性。尔后，在某些因素作用下，病毒被激活后并开始大量复制出现症状和各种合并症，则发展成艾滋病病人，HIV病毒很容易发生变异这是研制有效疫苗的主要困难之一。二、HIV实验室诊断人体感染HIV后，血液中最先出现HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出现。几周后出现IgM抗体并很快消失，此后,IgG抗体出现并一直存在。因此，HIV感染的实验室诊断以抗体检测为主，病
8、毒及相关抗原的检测为辅。抗体检测分为初筛试验和确证试验两种，初筛试验为阳性的血清必须进一步确证，确证为阳性的方可报告为HIV感染阳性。多聚酶链式反应(PCR)主要用于检测血浆中HIV的RNA含量，目前主要用于预测母亲将HIV传染给胎儿的可能性以及新生儿的HIV感染状况。此外，尚可用于判断病人的预后及监测抗病毒治疗的效果。（一）标本收集HIV感染者血清标本的收集按常规方法进行，静脉抽血，不加抗凝剂。标本在室温或4冰箱静置24小时，待血清析出后作抗体检测。污染标本可短时间离心后取上清液作检测，但解释结果时应慎重。用于检测HIV抗原的血液样本与检测抗体的样本的处理有所不同，根据需要，血液样本需进行核
9、酸处理。采用定量PCR方法检测病毒含量时，加入肝素的血浆，检测的RNA含量较未加肝素的血浆样本高。检验人员应注意自身的防护，在未证实之前，所有的标本均应当作“阳性”标本看待。（二）HIV抗体的初筛检测初筛试验的要求是敏感性高，理论上要求达到100%，尽可能避免漏掉可能阳性的对象，相对来说，对特异性要求不是太严，允许有少量假阳性，这些假阳性可以通过重复试验和确证试验排除。HIV抗体初筛检测的方法很多，如酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、明胶颗粒凝集实验(gelatineparticleagglutinationassay,PA)、乳胶凝
10、集实验(latexagglutinationassay,LA)、各种快速检测实验(rapidtests)、放射免疫实验(radioimmunoassay)等。这些实验使用的抗原早期是完整病毒的裂解产物，称为第一代试剂，这种抗原常常由于含有宿主细胞的成分而出现假阳性反应，为了获得可接受的特异性而稀释标本使试剂的敏感性也有所下降，同时这种抗原制备和纯化都比较困难，危险性大。第二代试剂使用重组或合成多肽HIV抗原，选择与免疫反应相关的抗原决定簇，敏感性和特异性均有所提高，这类抗原制备也更为安全、容易、重复性好。应该注意的是重组抗原有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，多肽抗原由于缺乏合适的立体构象
11、有可能使敏感性下降从而导致假阴性。使用重组或合成多肽抗原制备的双抗原夹心法试剂盒常常被称为第三代试剂，这种试剂可以检测针对HIV抗原的所有抗体亚类，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD，同时不需要将标本过度稀释来保证特异性，因而具有较高的敏感性。第四代试剂除使用重组或合成多肽抗原外还包被了P24抗体，可同时检测抗原和抗体。1酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（ELISA）是最常见的HIV抗体检测方法，它具有准确性高、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批量标本的检测，是献血员筛选和临床诊断最常用的方法。（1）方法和原理：使用最多的ELISA方法是间接法，这种方法
12、的原理是将HIV抗原包被到微孔板或其他固相载体上，如标本中含有HIV抗体，则抗体就会和固相载体上的HIV抗原结合，洗涤去除未结合的非特异性抗体，加入酶标记的抗人免疫球蛋白抗体与HIV抗体结合，形成HIV抗原HIV抗体酶标记的抗人免疫球蛋白抗体复合物，最后加入底物发生酶催化的显色反应，测定光密度值(opticaldensity,OD)，与判断标准进行比较，就可以得出标本中HIV抗体是阳性或阴性的结果了。间接法使用的标记抗体通常是抗人IgG，为了提高敏感性有时也加入抗人IgM。这种方法的特异性由包被于固相载体上的HIV抗原决定，相对来说特异性不高，存在非特异性问题。另一种常用的ELISA方法是双抗
13、原夹心法，将HIV抗原包被到固相载体上，标本中的HIV抗体与抗原结合形成复合物，由于抗体的双价或多价性，它同时还能与其他抗原结合，加入酶标记的同一类HIV抗原分子时，后者就会与固相载体上的抗体结合，形成HIV抗原HIV抗体酶标记HIV抗原复合物，最后加入底物发生酶催化的显色反应，测定光密度值，与判断标准进行比较，就可以得知标本中HIV抗体是阳性还是阴性。还有一种ELISA方法是竞争法。它的主要特点是酶标记抗体是特异性的HIV抗体。标本中的HIV抗体与酶标记HIV抗体竞争固相载体上的HIV抗原，操作时同时加入标本和酶标记HIV抗体，如标本中的抗体浓度高，酶标记HIV抗体就不能与固相载体上的HIV
14、抗原结合或结合得很少，显色反应就较弱，相反，如标本中的HIV抗体含量很少或没有，大量的酶标记HIV抗体将与固相载体上的HIV抗原结合，显色反应就很强。因而在竞争法中，光密度值与标本中的抗体含量呈负相关关系。这种方法是将标本与酶标抗体同时加入，需时更短，另外这种方法具有较好的特异性。（2）结果的判断：ELISA方法是根据临界值(cutoffvalue,CO)判断结果的。临界值是将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入厂商提供的计算公式计算出来的判断阳性和性结果的界值。对于间接法和双抗原夹心法，标本OD值与临界值的比值大于等于1（SCO1）为阳性；对于竞争法，标本OD值与临界值的比值小于等于1（S
15、CO1）为阳性。2从尿液中测抗体尿液艾滋病病毒（HIV1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（CalypteTMHIV-1尿液EIA）是酶免疫测定方法在体外检测尿液中HIV1抗体。此法用于实验室辅助临床HIV感染诊断。在确定标本HIV1抗体的结果之前，根据美国疾病控制中心推荐的HIV抗体的诊断步骤，此项检测重复阳性的标本，用卡里普特公司的剑桥生物HIV1尿液WesternBlot试剂盒进行确诊。近年与血液检查相比，尿液检查有多种优点。在尿液中一般不存在HIV病毒。卡里普特公司的剑桥生物HIV1尿液WesternBlot试剂盒，可对于尿液EIA重复阳性标本做确认实验。尿液艾滋病病毒（HIV1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（calypteTMHIV-1尿液EIA）是利用重组的HIV1表面抗原在尿液中检测HIV1抗体。微孔板的孔中包被gp160膜抗原。把尿液标本或对照与标本缓冲液一起加入孔中温育。如果标本中存在HIV1膜抗原的抗体，它们将与孔中的抗原结合。标本缓冲液用来减低孔中其它蛋白及抗体对孔壁的非特异性结合。通过洗涤去除未结合的物质。然后加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白抗体并温育。酶联物与孔中结合到抗原的HIV1抗体结合。洗涤去除未结合的酶联物，然后加入底物（p-NPP）。如标本中含有HIV1抗体，酶将使孔内液体由无色变为黄色，颜色的强度与标本中抗体含量成正比。反应用EDTA终止，用酶
