少突胶质前体细胞对脊髓伤治疗作用实验探究摘要：采用Allen' s重物撞击法建立小鼠SCI模型，致 小鼠脊髓损伤体外分离、培养和纯化GFP转基因鼠的OPCs 同时，对OPCs进行诱导分化通过眶静脉将OPCs移植到脊 髓损伤模型鼠体内体外实验证明分离、培养并纯化的OPCs 具有自我增殖的能力，并且可以分化为少突胶质细胞移植 后的OPCs不仅可以与宿主脊髓组织较好的整合，并可迁移 到损伤部位，替代损伤组织1.材料与方法.1. 1材料主要试剂为DMEM/F12 (1： 1)培养基，bFGF、PDGF胰 蛋白酶、胎牛血清、胎盘蓝染液、硫瑾染液、EDTA、多聚赖 氨酸抗体 A2B5、04、Cy3、Alax488、DAPI 和 PIC57BL/6 小鼠，B6C3-Tg (EGFP)加强型绿色荧光蛋白转基因1. 2方法皮层混合细胞培养：在解剖显微镜下，取0〜2d新生的 B6C3-Tg (EGFP)绿色荧光蛋白转基因小鼠，断头后迅速取 出鼠脑，清除脑膜，分离双侧大脑皮质，置于预冷的D-Hanks 液中漂洗2次，转入含无血清DMEM/F12培养液的离心管内, 用巴氏吸管反复吹打至组织块基本消失，200目不锈钢筛网 过滤，取滤液以1500rpm,离心5mino收集沉淀，加入完 全培养液(DMEM/F12、10%FBS. 1%双抗)lml,用吸管吹打 制成细胞悬液，计数后接种T-75培养瓶中，密度为 2X105/mlo 37°C 5%C02条件下培养，以后每2〜3d换液1 次。
胚胎OPCs的分离和纯化：原代培养至9〜lid时，根据 培养体系内星形胶质细胞融合及细胞分层情况进行振荡分 离振荡前，更换新鲜的基本培养基孵育24 h,将培养瓶转 移至恒温振荡器上进行初步振荡处理(220rpni, 37°C , 30min)o弃掉旧培养基，用无菌PBS清洗培养瓶3次，加入 新鲜基础培养基8-10ml/瓶，转入培养箱继续孵育lh,再次 将培养瓶置于恒温振荡器上进行过夜振荡处理(300rpm, 37°C, 4〜6h)收集振荡后细胞悬液并离心(1200 rpm, 4°C, 10min)o用2〜3ml基本培养基重新悬浮细胞，将其接种于 未包被多聚赖氨酸的培养皿内，入培养箱孵育20-30mino再 取悬液并离心(1200rpm, 4°C , 5min)可去除大部分星形 胶质细胞和成纤维细胞用1〜加lOPCs培养基重新悬浮细 胞，接种于包被多聚赖氨酸的培养瓶上，前两天进行1 /3 量换液培养5d后，弃去培养基，加入少许DMEM /F12 清洗1次，洗去细胞碎片；加入0. 25%的胰酶消化15〜 20sec后立即加入血清终止消化，在倒置显微镜下观察，如 仍有较多细胞贴壁可将培养瓶水平放置在脱色摇床上慢速摇晃1〜2rniri,吸取细胞悬液置于培养皿中，20min后收集 细胞悬液并离心，弃上清液，用OPCs完全清培养基重悬细 胞接种于多聚赖氨酸预处理的培养瓶中，转入细胞培养箱中 继续培养。
小鼠脊髓损伤模型建立及分组：根据Allen' s等的重 物撞击法建立SCI小鼠模型成年C57BL/6小鼠32只，体 重16〜18g,随机分为4组，即模型组、假手术组、细胞移 植组和细胞液移植组，每组8只模型制作与Allen，s的 方法基本一致，但略有变动在261下，将麻醉后小鼠，俯 卧于手术台上，根据棘突的体表定位确定手术切口后，将手术区域剪毛备皮处理，用碘伏、70%酒精彻底消毒皮肤取 背部正中切口，逐层切开皮肤、皮下组织、筋膜沿棘突向 两侧剥离棘旁肌，充分显露T8-T12棘突及相应椎板咬除T9-T11棘突，切除T10全椎板,充分暴露相应脊髓节段以5.0g, 0. 5mm/sec的致伤速率打击脊髓造成小鼠SCI造模 成功后逐层缝合切口OPCs的移植：在模型制备后的第7天行细胞移植，其中细胞移植组给予OPCs移植治疗，细胞液移植组给予培养基 注射治疗，模型组和假手术组不做任何处理细胞计数后将 其浓度调整为5X106细胞/10uL/只将小鼠麻醉、固定， 右手持微量注射器，沿右眼或左眼眶下壁，以45角刺入, 刺入深度约2〜3mm，若遇阻力稍后退调整角度后再刺入，缓 慢将细胞悬液推入眶后静脉丛。
留针2分钟后缓慢拔针行为学判定： 实验采用常用Basso , Beattie and Bresnahan (BBB)运动功能评分观察研究OPCs移植术后小 鼠后肢运动功能的恢复情况将小鼠后肢运动功能分为22 (0-21)个等级，完全性瘫痪为0分，功能正常常为21分 观察时将受试动物置于lm2的空旷、不滑的平面场地上，使 其适应场地活动然后连续观察4min自由活动免疫细胞化学染色：分别将纯化后的OPCs用PBS洗涤2 次，用4%多聚甲醛固定20分钟，进行A2E5免疫细胞化学检 测取材：分别于术后7d, 14d和21d,先用生理盐水再用 4%多聚甲醛进行心脏灌流固定，后取出脊髓组织，分别经15% 及30%蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片，片厚5umo2.结果：OPCs的增殖：纯化接种后即刻在相差显微镜下观察，细 胞呈圆形小亮点，折光性强，未表现明显细胞形态，培养24h 后，细胞贴壁生长随着培养时间增加，细胞不断增殖且逐 渐相互连接融合，呈现出典型的细胞形态，表现为圆形胞体 具有双极突起OPCs的鉴定：原代或纯化后的OPCs,用免疫细胞化学 法检测，呈A2B5阳性表达免疫荧光染色显示，A2B5染色 阳性细胞为胞膜着色，呈红色；DAPI为核染色，呈蓝色。
OPCs的分化：分离纯化后OPCs加入含有10%胎牛血清, 48h后即发现细胞球周边细胞开始伸出多个突起向远处呈放 射状生长，细胞与细胞互相连接形成少突胶质细胞脊髓损伤及细胞移植后小鼠的行为学观察：各组小鼠于 术后lh左右苏醒，醒后观察发现，双下肢呈瘫痪状态、感 觉、运动功能完成丧失头部、前肢运动功能正常，可以拖 着后部肢体移动；而假手术组行动正常，无上述截瘫症状， 二者比较有显著统计学差异 小鼠的组织学鉴定：模型组小鼠脊髓损伤部位与周围组织明显不同，较正常脊髓变 细断面观察见损伤处结构紊乱，灰、白质部间界限模糊， 组织结构疏松，甚至出现大量的空泡变性，可见凋亡的神经 元及大量增生、浸润的炎性细胞假手术组脊髓组织基本正 常，灰、白质组织结构致密，神经纤维排列整齐，神经元胞 核圆大，核仁清晰，其内未见增生、浸润的炎性细胞OPCs 移植组，较移植对照组和模型组病变有所减轻，其灰白质区 域之间界限更清晰，组织结构排列更紧密，残留的白质区域 面积更大，其内所形成的空洞更小更少，损伤灶的中心和周 缘均可见到移植的呈绿色的OPCs,在损伤灶以外的组织中很 少见到移植的OPCso在培养液移植组的脑组织中未见到移植 的 OPCso本实验显示，OPCs移植后小鼠运动功能恢复明显好于培 养液移植组，移植3-4d后即可明显地改善脊脊髓伤小鼠的 运动功能。
总之，本实验提示OPCs移植对于修复受损脊髓 组织是一种有效的治疗方法，为临床细胞移植治疗其它神经 系统疾病提供理论基础参考文献[llRonaghi M, Erceg S, Morenor M anzano V, etal. Challenges of stem cell therapy for spinal cord： human embryonic stem cells, endogenous neural stem cells, or induced pluripotent stem cells ? [J]・Stem Cells, 2009, 28 (1)： 93-99[2] Faulkner J, Keirstead HS・Human embryonic stem cell-derived oligendrocyte progenitors for the treatment of spinal cord injury[J]・Transpl Immunol, 2005, 15 (2)： 131-142[3] Kohama I, Lankfbrd KL, PreiningeroVa J, et al. Trransplantation of cryopreserVed aduIt human Schwann cells enhances axonal conduction in demyelinated spinal cord. J. Neurosci, 2001： 21： 944一950.[4] Allen AR. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of facture dislocatoon od spinal colum. JAMA, 1911； 57: 878-880.。