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1、. .脾虚证物质能量代谢基因差异表达及其生物信息分析-?广州中医药大学?2012年博士论文研究背景和目的：中医“脾主运化、脾为“后天之本,气血生化之源之说,提醒脾对于饮食物具有消化吸收和输转的功能,同时脾通过营养物质在体内的代谢,为人体出生以后生长发育及生命活动提供能量和物质根底。物质能量代谢是生命活动的物质根底,它包括消化吸收、中间代谢和排泄三个阶段,中间代谢是机体内代谢的主体,包括糖、脂、蛋白质、核酸、微量元素和能量代谢等(本论文物质代谢特指糖、脂、蛋白质、核酸和微量元素代谢)。目前已有大量的研究证实脾虚动物存在消化吸收和营养代谢障碍,在中间代谢方面表现为糖原含量降低；血脂含量和生物膜构造
2、异常；氨基酸和蛋白含量降低；组织DNA和RNA含量降低；线粒体构造异常,ATP含量降低；微量元素含量异常等,可见,脾与物质能量代谢在病理上也表现出高度的一致。目前脾虚证与物质能量代谢相关性研究主要以对某一代谢相关生化指标的测定为主,缺乏对脾虚证机体整个物质能量代谢的同步研究。基因芯片技术作为一个“组学研究方法,与中医的“整体观有很多相似之处,它可以反映机体某一状态所有基因的表达情况。因此,在本世纪初,基因芯片技术就已经广泛用于脾虚证动物模型的研究,但是由于我国利用基因芯片技术研究脾虚证的起步相对较晚,基因芯片数据的分析存在一些明显缺乏,如对芯片数据的预处理不够,对差异表达基因缺乏统计学检验,并
3、且对于差异表达基因的功能注释也过于单一,最终导致对芯片数据的解读浮于外表,未能到达预期目的。随着分子生物学和生物信息学的开展,一些专业的生物信息学软件已经广泛用于基因芯片数据的分析,这大大提高了基因芯片数据的解读能力,并且随着大量基因芯片数据的积累,使得广泛利用现有基因芯片数据来解读脾虚证的发病机制比少量基因芯片实验本身更为重要。对此,在课题组应用基因芯片研究慢性浅表性胃炎脾气虚证(下称脾虚证)基因表达谱的工作根底上,本文利用BRB ArrayTools和IPA软件对慢性浅表性胃炎(下称慢性胃炎)脾虚证患者(分别以安康志愿者和脾胃湿热证患者作为对照)和非幽门螺杆菌(Helicobacter p
4、ylori, Hp)感染脾虚证患者(与Hp感染脾胃湿热证患者相比)基因芯片数据进展深入挖掘,通过对前者物质能量代谢相关差异表达基因分析,探讨脾虚证与物质能量代谢的相关性,从机体整个物质能量代谢水平认识脾的生理功能和脾虚证的发病机制；通过对后者差异表达基因分析,探讨Hp的致病机制,同时认识“慢性胃炎脾胃湿热证患者Hp感染率明显比脾虚证患者高这一临床现象的遗传背景,为中医分型和Hp相关疾病的治疗提供理论依据。此外,论文还汇总了近10年气虚证或体质人和脾虚大鼠模型差异表达基因,通过对脾虚证患者、气虚证或体质人和脾虚大鼠模型物质能量代谢相关差异表达基因的相似性比拟,探讨脾虚证基因表达谱的特征,并筛选出
5、脾虚证特征性代谢基因和代谢途径,从基因组学的角度为中医脾根底理论的现代科学诠释和脾虚证临床辨证分型提供参考,并为脾虚证的病理生理研究提供线索。材料与方法：一、材料(一)基因芯片数据来源慢性胃炎脾虚证患者与安康志愿者比拟和脾虚证患者与脾胃湿热证患者比拟的基因芯片原始数据,以及慢性胃炎非Hp感染脾虚证患者与Hp感染脾胃湿热证患者比拟的基因芯片原始数据全部来自于课题组脾虚证发病机理研究的前期数据,并已有相关论文发表。包括肺气虚证、气阴两虚证、气虚体质在内的气虚证或体质人差异表达基因全部来源于公开发表的学术论文和学位论文。包括不同建模方法和组织来源的脾虚大鼠模型差异表达基因全部来源于公开发表的学术论文
6、和学位论文。(二)用于脾虚证与脾胃湿热证比拟的差异表达基因验证的荧光定量PCR实验病例来源1.诊断标准及辨证分型标准慢性胃炎西医诊断和辨证分型标准以及Hp诊断标准全部采用课题组原实验设计标准(王颖芳,广州中医药大学2006届博士学位论文),具体如下：(1)慢性胃炎诊断标准参照?中药新药临床研究指导原那么?。(2)脾气虚证辨证标准主症：舌质淡、舌体胖或有齿印,苔薄白；胃纳减少或食欲差；腹胀；大便溏或腹泻。次症：消瘦；体倦乏力；脉细弱。判断：a)主症必备。b)兼具主症、之二；或兼具主症、之一,同时兼具2个以上次症,诊断可成立。(3)脾胃湿热证辨证标准主症：舌苔黄腻；胸闷；胃脘痞满或胀痛；食欲不振。
7、次症：口苦而黏；口渴少饮,或喜热饮；大便溏,或有黏液；恶心；身困乏力；脉濡缓,或滑。判断：a)主症必备。b)兼具主症、之二,或兼具主症、之一,同时兼具2个以上次症；或兼具3个以上次症,诊断可成立。(4)Hp诊断标准患者近一个月内未服用抗生素类药物。病理切片染色与快速尿素酶试验二者均为阳性即为Hp感染。两者均为阴性即为非Hp感染。2.纳入及排除标准同时符合慢性胃炎非Hp感染脾虚证或Hp感染脾胃湿热证,并同意签署由学术道德委员会批准的?知情同意书?的患者纳入。年龄在18岁以下或65岁以上,妊娠或哺乳妇女,过敏体质者,或存在消化道其它器质性病变、心、脑、肝、肾、造血系统等严重原发性疾病及精神性疾病等
8、患者被排除。二、方法(一)脾虚证患者差异表达基因分析慢性胃炎脾虚证患者与安康志愿者比拟和脾虚证患者与脾胃湿热证患者比拟的基因芯片原始数据,以及慢性胃炎非Hp感染脾虚证患者与Hp感染脾胃湿热证患者比拟的基因芯片原始数据,采用下述方法进展分析处理：1.基因芯片数据的预处理和数据筛选对Cy5和Cy3信号值进展均一化处理,消除两标记体系间的系统误差。参与均一化处理的有效基因点的条件：(1)该基因点的Cy3和Cy5信号值都大于200,或者其中之一大于800；(2)该基因点的Cy5信号值/Cy3信号值的比值在0.1-10之间。均一化系数计算方法：计算每个有效基因点Cy5信号值/Cy3信号值的比值,求出其相
9、应的自然对数值r=ln(Cy5/Cy3),算出全部有效基因点r值的平均值R,那么实验的均一化系数就等于R的倒数即(1/R)。将所有基因点的Cy3信号值乘上均一化系数,得出调整后的Cy3*,即Cy3*=Cy3(1/R),并将所有小于200的Cy3*值以200取代,所有小于200的Cy5信号值用200替代。将Cy5和Cy3*信号值输入芯片分析软件BRBArrayTools4.1.0Beta2进展数据筛选,包括对数转换、中位值标准化和基因筛选。其中某个基因被保存用于后续分析的基因筛选条件是：该基因的Cy5/Cy3*比值必须有超过20%的样本大于1.5,且不能有超过50%的数据缺失。对筛选后的数据进展
10、功能注释和进一步分析。2.GO和KEGG基因集分析对筛选后的芯片数据进展GO和KEGG基因集分析。基因芯片分析时,将安康志愿者或脾胃湿热证患者作为对照组,将脾虚证患者作为实验组。Hp分析时,将非Hp感染脾虚证患者作为对照组,Hp感染脾胃湿热证患者作为实验组。采用配对t检验的方法,显著性检验方法为LS/KS排列检验和Efron-Tibshiranis基因集分析最大均值检验(GSA maxmean test), P0.005。3.芯片间分类比照分析(1)差异表达基因筛选对筛选后的数据进展芯片间的分类比照分析。基因芯片分析时,实验组和对照组设置同上。采用配对t检验的统计方法,将同时满足P0.05或p
11、0.01或p0.001和表达倍数2的基因设定为差异表达基因。对表达倍数1的基因数据进展负倒数转换,因此倍数为正的基因是实验组上调基因,负值表示实验组下调基因,分别标记为“和“。(2)差异表达基因生物信息分析将差异表达基因ID和表达倍数导入IPA8.6在线软件对差异表达基因进展注释、相互作用网络等生物学功能分析。对于脾虚证分别与安康志愿者和脾胃湿热证患者比拟的差异表达基因根据BRB Array Tools软件的GO功能分析中的生物学过程和KEGG通路以及IPA在线软件的生物学功能分类和基因的生物学注释四方面信息综合确定物质能量代谢相关基因,分析脾虚证与物质能量代谢的相关性；对于非Hp感染脾虚证差
12、异表达基因,通过差异表达基因功能注释和相互作用网络分析,探讨Hp的致病机制,为中医分型和Hp相关疾病的治疗提供理论依据。(3)基于差异表达基因的聚类分析利用BRB Array Tools软件的聚类功能,选择基因中心化、一减相关系数和平均连接簇设置,以选定的差异表达基因作为分析对象(Hp分析时选定所有差异表达基因,其他两组芯片分析选定物质能量代谢相关差异表达基因),对样本和基因进展层级聚类分析。(二)脾虚证患者、气虚证或体质人和脾虚大鼠模型物质能量代谢相关差异表达基因相似性比拟1.脾虚证患者两组芯片的物质能量代谢基因之间相似性比拟对脾虚证患者与安康志愿者比拟的物质能量代谢相关差异表达基因和脾虚证
13、与脾胃湿热证患者比拟的物质能量代谢相关差异表达基因进展相似性比拟,分析脾虚证患者差异表达基因的特征,并筛选出脾虚证患者特征性的基因和代谢途径,进一步探讨脾虚证与物质能量代谢的关系。2.脾虚证患者物质能量代谢基因和气虚证或体质人物质能量代谢基因相似性比拟检索并汇总文献报道的气虚证或体质人差异表达基因,按照上述物质能量代谢相关基因的界定方法,筛选出物质能量代谢相关差异表达基因,并与脾虚证患者物质能量代谢差异表达基因进展比拟,探讨脾虚证患者和气虚证或体质人在物质能量代谢基因差异表达上的异同,从而确定物质能量代谢异常是脾虚证患者特有的病理现象还是气虚证所共有的病理机制。3.脾虚证患者物质能量代谢基因和
14、脾虚大鼠模型物质能量代谢基因相似性比拟检索并汇总文献报道的脾虚大鼠模型差异表达基因,按照上述方法2,进展分析,探讨脾虚证特有的代谢基因和途径。(三)脾虚证与脾胃湿热证比拟的差异表达基因荧光定量PCR验证1.胃黏膜组织的采集在广东省中医院收集慢性胃炎非Hp感染脾虚证和Hp感染脾胃湿热证患者各4例,胃镜下钳取胃窦黏膜活检组织200mg左右,液氮保存备用。2.荧光定量PCR实验论文对慢性胃炎非Hp感染脾虚证与Hp感染脾胃湿热证比拟的差异表达基因HLA-DRB1、SCGN、COX7B和SULT1A4四个基因进展定量PCR验证。实验采用SYBR Green I的方法,利用primer express2.
15、0软件设计引物,并按照相关试剂盒说明书提取总RNA、进展荧光定量RT-PCR反响,采用Ct的方法计算实验组与对照组之间的相对含量。结果：一、脾虚证患者差异表达基因(一)脾虚证与安康志愿者比拟的物质能量代谢相关差异表达基因(1)GO分析获得287个有显著性意义的基因集,其中细胞成分49个、分子功能60个,生物学过程178个。KEGG分析获得11个有显著性意义的代谢通路。GO生物学过程和KEGG通路显示,脾虚证患者在涉及脂、蛋白质、核酸和糖代谢的相关基因表达异常。(2)分类比照分析获得15个物质能量代谢相关差异表达基因,占总差异表达基因的75%(15/20),其中下调基因14个,酶基因或有酶活性的基因11个(73%),它们参与机体脂、蛋白质、核酸和糖代谢过程。与脂类代谢相关的基因有ACAA2和CYP20A1,表现为脂肪酸分解和胆固醇转化降低；与蛋白质代谢相关的基因有RPS28、B3GNT1、GCNT1、PPP1R3C、UBXN1、UBE2D2、ASL、 ASS1和PCYOX
