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1、. .嗜盐紫色硫细菌耐盐机制与光合色素研究【摘要】：紫色硫细菌是不产氧光合细菌中的一个生境独特的类群,大约出现在3.5Ga年前,是深入理解生命起源、自然界碳氮硫在物质循环中的作用、以及提醒不产氧光合作用机理的良好模型生物,在去除污染水体有机物、氮和磷以及有毒物质硫化物中也具有重要的应用价值。因该类群大多数种类生境特殊,较难获得纯培养物、菌种生长不良易于丧失,因此对其研究远不如紫色非硫细菌深入和广泛。奥氏酮(Okenone)类胡萝卜素是迄今发现的最古老的生物标志之一,已被用作研究地球进化和环境适应机制的一个有效工具,目前发现它仅出现在紫色硫细菌的15个种类中。本课题组从青岛东风盐场别离获得一株含
2、有独特光合色素-奥氏酮的嗜盐紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1。本文对该菌株的生物学特性、耐盐特性和耐盐机制、光合色素组份分析、环境因子对色素合成的影响、尤其是Okenone的特性和理化性质进展了系统研究,研究结果显示出Okenone类胡萝卜素性能稳定,耐热性、抗光性良好,高色价且色泽鲜艳,具有良好的特性,因此本文又进一步对Okenone的产量进展了优化。主要研究结果如下：1.生物学特性研究结果说明,紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1对氧气敏感,最高能够耐受150g/LNaCl,1.8g/LNa2S.9H2O,7.7g/LNaNO2,能在pH6-9,温度
3、1545,光照强度100-8000Lux的范围内生长。不同的碳源、氮源、盐度、pH、光照、温度对菌体形态和胞内硫粒数量都有影响。高盐胁迫下细胞形态多样,体积增大,比外表积减小；在碱性和低温环境中细胞呈棒状而且体积较大,胞内积累较多的硫粒；高温下,细胞呈长杆状,体积变大,胞内积累较多硫粒。2.Marichromatiunsp.283-1是一株厌氧中度嗜盐紫色硫细菌,对其耐盐特性和耐盐机制进展了初步研究。结果说明随着盐度增加菌株283-1生长的延滞期延长,对Na+有专一依赖性,而对C1-依赖性较弱；它主要通过在胞内积累相容性溶质甜菜碱来对抗胞外渗透压力,胞内甜菜碱的含量随培养基NaCl浓度的增加而
4、增加,2.0mol/LNaCl浓度时胞内甜菜碱含量可到达156.4mg/g细胞干重。外源添加甜菜碱可以明显提高菌株283-1耐盐生长的能力。因此,菌株283-1是通过胞内积累甜菜碱来调节细胞内外渗透压平衡,外源添加甜菜碱可以明显提高该菌株对盐的耐受能力。3.为了解决紫色硫细菌生物量普遍较低的问题,对其生长培养基进展了优化。采用单因子试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验及中心组合设计响应面分析,研究了乙酸钠、碳酸氢钠、氯化铵、硫化钠、硫酸镁和无机盐6个因子对菌株283-1生物量的影响。结果说明,乙酸钠和硫化钠是影响该菌株生物量的主要因素,并获得了最正确培养基配方。优化后菌株生长
5、速率提高,延迟期缩短,生物量提高了6倍,并且结果与理论预测值相近。4.采用丙酮甲醇法提取菌体色素,通过UV-VIS、TLC、HPLC、MS和图像灰度分析等方法全面分析了该菌株的光合色素。结果说明：光照厌氧条件下,菌株283-1主要积累8种光合色素,包括BChlaGG、BChlaDHGG、BChlaTHGG和BChlap4种细菌叶绿素,1种BPhe和OH-R.g-keto、R.g-keto和Okenone3种类胡萝卜素,其中细菌叶绿素BChlaP和类胡萝卜素Okenone含量最高,分别占总色素含量的39.6%和47.4%。同时建立了菌株283-1全色素的TLC和HPLC指纹图谱,这两种指纹图谱分
6、析方法均能进展光合色素的快速分析,适合于紫色硫细菌Okenone系合成途径中和BChla合成途径中主要积累色素组分和含量变化规律的研究。5.利用构建的指纹图谱研究了环境因子光照、温度和盐度对菌株色素合成的影响,结果说明：光照强度的变化主要影响类胡萝卜素和细菌叶绿素单位细胞的含量,对色素组份影响不明显；温度的对色素组份影响较大,低温(20)时,积累的类胡萝卜素主要是Okenone,TLC指纹图谱未检测到另外两种类胡萝卜素。在30,2000Lux时,细菌叶绿素和类胡萝卜素单位细胞含量最高；而在45,5000Lux时,细菌叶绿素和类胡萝卜素单位细胞含量最低。盐度变化不影响菌株的色素组份,但对各组分的
7、相对含量影响较大。高盐(11%NaCl)下,BChlap和BPhe的积累量明显增加,尤其是BChlap的相对含量增加约70%；但是,OH-R.g-ketoI的积累量下调了40%。低盐(1%NaCl)下,BPhe和Okenone的相对含量明显上调。6.Okenone类胡萝卜素作为地球进化过程一种重要的生物标志物。菌株283-1胞内可积累大量的Okenone系类胡萝卜素。在紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1光合色素组成分析的根底上,通过丙酮甲醇提取、皂化、TLC和HPLC分析、制备得到纯化的Okenone类胡萝卜素,并研究了光(包括紫外线)、温度、pH、金属离子、氧化剂、复原剂
8、、自由基和食品添加剂等对Okenone类胡萝卜素稳定性的影响。结果说明,在暗处、1000Lux光照强度和4、30、50的条件下,Okenone具有很好的稳定性,有很高的耐光和耐热能力；强酸和强碱对Okenone破坏较大；对食品添加剂和多数金属离子稳定,但是Fe3+、Mg2+、Al3+和Cu2+的影响较大,尤其是Fe3+,因此,Okenone存放时应防止与这些物质接触。Okenone类胡萝卜素吸收光谱形状和精细构造受到有机溶剂极性的影响,当溶剂由非极性转变为极性时,其精细构造减弱或消失,吸收峰趋于平滑。Okenone在石油醚溶液中呈鲜艳的橙红色,色价为40000。Okenone对紫外辐射具有较强
9、的吸收作用,因此它可通过牺牲自己起到防护作用。以DPPH作为自由基检测试剂,测定了该类胡萝卜素去除DPPH自由基能力,结果说明它具有抗氧化生物活性,EC50=0.022mg/mL。7.在优化了生物量的根底上,继续通过响应面分析法研究了培养基中5种无机盐和微量元素对菌株283-1Okenone类胡萝卜素积累的影响。结果说明：培养基中微量元素、碳酸氢钠和磷酸二氢钾显著影响Okenone类胡萝卜素在胞内的积累,通过BehnkenBox试验设计,得到了最正确培养基配方。在优化培养基中,Okenone产量由原来的1.454mg/L提高到了2.926mg/L,提高了101.2%【关键词】：紫色硫细菌耐盐机
10、制光合色素奥氏酮稳定性【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q93【目录】：中文摘要12-15ABSTRACT15-19第一章绪论19-361.1紫色硫细菌概述19-221.1.1紫色硫细菌的系统分类191.1.2紫色硫细菌的生理生态特征19-211.1.3紫色硫细菌的应用21-221.2中度嗜盐菌概述22-231.2.1中度嗜盐菌的耐盐机制22-231.2.2中度嗜盐菌的应用231.3光合色素概述23-311.3.1类胡萝卜素24-261.3.2细菌叶绿素26-281.3.3光合色素分析方法28-311.4影响微生物色素合成的因素31-321.4.
11、1培养基成分对微生物色素合成的影响311.4.2环境因素对微生物色素合成的影响31-321.4.3金属离子和无机盐对微生物色素合成的影响321.4.4添加有机物对微生物色素合成的影响321.5本课题研究目的和意义32-36第二章嗜盐紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1的生物学特性36-452.1材料与方法36-382.1.1材料362.1.2方法36-382.2结果38-432.2.1细胞形态382.2.2NaCl耐受性382.2.3氧气敏感性测试38-392.2.4碳源、氮源和硫化物利用能力392.2.5硫化物的耐受能力39-402.2.6亚硝酸钠的耐受能力402.2.7环
12、境条件对菌株生长的影响40-412.2.8不同条件下283-1细胞形态41-432.3结论43-45第三章嗜盐紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1的耐盐机制45-523.1材料与方法45-473.1.1材料45-463.1.2方法46-473.2.结果47-503.2.1不同NaCl浓度对菌株生长的影响47-483.2.2不同种类阴阳离子对菌株283-1生长的影响483.2.3不同渗透压冲击对菌株283-1耐盐生长的影响48-493.2.4外加相容性溶质对菌株283-1耐盐生长的影响493.2.5不同盐浓度下菌株283-1胞内游离氨基酸的积累49-503.2.6不同盐浓度下菌
13、株283-1胞内甜菜碱的积累503.3结论50-52第四章嗜盐紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1生长培养基优化52-594.1材料与方法52-544.1.1材料52-534.1.2方法53-544.2结果与分析54-574.2.1单因素试验544.2.2Plackett-Burman试验54-554.2.3最陡爬坡试验554.2.4中心组合试验和响应面分析55-574.2.5验证试验574.3结论57-59第五章嗜盐紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1光合色素分析及环境因子对色素合成的影响59-725.1材料与方法59-615.1.1材料59-605.1.
14、2方法60-615.2结果与分析61-705.2.1活细胞吸收光谱61-625.2.2色素的提取和含量测定625.2.3TLC色素指纹图谱分析和灰度分析62-635.2.4TLC色素指纹光谱学特征63-645.2.5HPLC色素指纹图谱64-655.2.6MS分析655.2.7色素组分定性分析65-665.2.8环境因子对色素合成的影响66-705.3结论70-72第六章嗜盐紫色硫细菌生物标志物Okenone的别离鉴定和性质研究72-866.1材料与方法72-756.1.1材料72-736.1.2方法73-756.2结果与分析75-846.2.1Okenone类胡萝卜素的制备和鉴定756.2.
15、2Okenone类胡萝卜素色价和溶剂效应75-776.2.3光照强度对Okenone类胡萝卜素的影响77-796.2.4Okenone类胡萝卜素的热稳定性796.2.5酸碱对Okenone类胡萝卜素稳定性的影响79-826.2.6金属离子、食品添加剂和氧化复原剂对Okenone稳定性影响826.2.7Okenone类胡萝卜素抗紫辐射能力82-836.2.8Okenone类胡萝卜素去除DPPH自由基能力83-846.3结论84-86第七章响应面法优化Okenone类胡萝卜素发酵培养基86-967.1材料与方法87-887.1.1材料877.1.2方法87-887.2结果与分析88-947.2.1Plackett-Burman试验88-897.2.2最陡爬坡试验89-907.2.3Box-Benhken试验设计和响应面分析90-937.2.4验证试验93-947.3结论94-96第八章主要结论、创新点与研究展望96-97参考文献97-114攻读学位期间取得的研究成果114-115致谢115-116个人简况及联系方式116-118 本论文购置请联系页眉网站。. v .
