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1、 第五章第五章 生物技术原理生物技术原理 2121世纪是生命科学与生物技术的世纪，生物技术被世界各国视为世纪是生命科学与生物技术的世纪，生物技术被世界各国视为一项高新技术，广泛应用于农业、工业、医药卫生、食品、化工一项高新技术，广泛应用于农业、工业、医药卫生、食品、化工能源等各行各业，正在对人类社会生活产生深远影响。能源等各行各业，正在对人类社会生活产生深远影响。传统生物技术传统生物技术: :酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶现代生物技术现代生物技术:20:20世纪世纪7070年代末年代末8080年代初年代初, ,基因工程基因工程 生物技术生物技术生生物物技技术术也也称称
2、为为生生物物工工程程，是是指指以以现现代代生生命命科科学学为为基基础础，结结合合其其它它基基础础学学科科的的科科学学原原理理，采采用用先先进进的的工工程程技技术术手手段段，改改造造或或重重新新设设计计细细胞胞的的遗遗传传物物质质，按按照照预预先先的的设设计计改改造造生生物物体体，获获得得优优良良品品质质的的动动物物、植植物物和和微微生生物物品品系系，或或加加工工生生物物原原料料，为为人人类类生生产产出出所所需需产产品品，达达到到提高社会生产力和生活质量的目的。提高社会生产力和生活质量的目的。基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程蛋白质工程蛋白质工程生物技术生物技术第一节第
3、一节 基因工程操作原理（基因工程操作原理（P133P133）n一、什么是基因工程一、什么是基因工程n二、基因工程操作技术及原理二、基因工程操作技术及原理一、一、什么是基因工程什么是基因工程v概念概念：也叫也叫基因操作基因操作遗传工程遗传工程重组重组DNA技术技术v基因工程主要原理基因工程主要原理v基因工程四个步骤基因工程四个步骤用人工方法，把生物的遗传物质分离出来，在体外用人工方法，把生物的遗传物质分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表进行基因切割、连接、重组、转移和表达的技术。达的技术。克隆目的基因，取得所需要的克隆目的基因，取得所需要的DNA特异片段。特异片段。与与DNA载体连
4、接成重组载体连接成重组DNA。引入细菌或动植物细胞并使其增殖。引入细菌或动植物细胞并使其增殖。挑选出受体细胞，指导合成蛋白质或优良新品种。挑选出受体细胞，指导合成蛋白质或优良新品种。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理（一）核酸分子的提取技术（一）核酸分子的提取技术（二）电泳技术（二）电泳技术（三）各种酶的使用（三）各种酶的使用（四）基因克隆（四）基因克隆（五）体外重组（五）体外重组（六）载体构建（六）载体构建（七）转化（七）转化（八）重组体的筛选与鉴定（八）重组体的筛选与鉴定（九）培育新型品种（九）培育新型品种二、基因工程操作技术及原理二、基因工程操作技术及原理第一节第一节 基因工
5、程操作原理基因工程操作原理v分类：分类：v方法：方法：（一）核酸分子的提取技术（一）核酸分子的提取技术RNARNA的提取的提取总总DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取 首先首先，粉碎组织细胞；，粉碎组织细胞；其次其次，DNADNA用乙醇等进行沉淀；用乙醇等进行沉淀；最后最后，用苯酚、氯仿等洗涤，用苯酚、氯仿等洗涤 纯化。纯化。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理（二）电泳技术（二）电泳技术带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。各种生物大分子在一定各种生物大分子在一定pHpH值条件下，可以解离成带值条件下，可以解
6、离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。v分类：分类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。场凝胶电泳。v概念：概念：第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理总总RNARNA总总DNADNA质粒质粒DNADNA第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理（三）各种酶的使用（三）各种酶的使用1 1、限制性内切酶的使用、限制性内切酶的使用v分类分类：型酶、型酶、型酶型酶和和型酶。型酶。v概念概念：是一类能识别是一类能识别双链双链DNADNA中
7、特殊核苷酸序中特殊核苷酸序列，并在合适的条件下列，并在合适的条件下使每一条链一定位点上使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产的磷酸二酯键断开，产生具有生具有3-OH3-OH基团和基团和5-P5-P基团的基团的DNADNA片段的片段的内切脱氧核糖核酸酶。内切脱氧核糖核酸酶。 用用质粒质粒构建构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理重组重组DNADNA分子分子用用噬菌体噬菌体DNADNA构建构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理重组重组DNADNA分子分子限制性内切酶造成限制性内切酶造成粘性末端粘性末端有利于重组有利于重组DNA DNA 分分子的构建子的构建第一节第一节 基
8、因工程操作原理基因工程操作原理2 2、DNADNA连接酶的使用连接酶的使用vDNA连接酶连接酶能够催化具有能够催化具有3-OH基团和基团和5-P基团的基团的DNA片段之间片段之间形成磷酸二酯形成磷酸二酯键。在基因克键。在基因克隆中用来连接隆中用来连接载体与目的基载体与目的基因。因。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理vDNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3-OH端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是具有耐热性质的端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是具有耐热性质的DNA聚合酶的分离极大促进了基因等聚合酶的分离极大促进了基因
9、等DNA片段的体外合成与扩片段的体外合成与扩增技术的发展。增技术的发展。3 3、DNADNA聚合酶的使用聚合酶的使用第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理4 4、逆转录酶的使用、逆转录酶的使用v逆转录酶可以逆转录酶可以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA，即，即cDNAcDNA（互（互补补DNADNA）。在基因）。在基因克隆中常用来构克隆中常用来构建建cDNAcDNA文库。文库。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理（四）基因克隆（四）基因克隆第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理553333555 5 333 3 55+变性变性(94)复性复性(55)5 5
10、33P P1 13355+P2+P P1 1P2合成（合成（7272）PCR一般用一般用PCR PCR 扩增扩增方法，根据已知方法，根据已知基因的序列设计基因的序列设计引物来克隆基因。引物来克隆基因。1、克隆已知基、克隆已知基因序列的基因因序列的基因第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理v在某种植物在某种植物的同源基因被的同源基因被克隆的条件下，克隆的条件下，可先构建可先构建cDNA cDNA 文库或基因组文库或基因组文库，然后以文库，然后以该基因（或部该基因（或部分序列）为探分序列）为探针来筛选目的针来筛选目的基因的克隆。基因的克隆。v作
11、图克隆技术是随着分子标记作图克隆技术是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。根据连锁图谱定位的基隆技术。根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。克隆植物分因来克隆目的基因。克隆植物分子连锁图谱定位的基因，可采用子连锁图谱定位的基因，可采用作图克隆的策略。作图克隆是从作图克隆的策略。作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆连锁标记出发，通过大片段克隆（BACBAC或或YACYAC库）的染色体步移到库）的染色体步移到达靶基因。达靶基因。 第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理3 3、作图克隆、作图克隆v根据基因的产物蛋白质克隆基因。首先根据已知的生化缺陷
12、或特征确认根据基因的产物蛋白质克隆基因。首先根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的氨基酸序列，推测可能的mRNAmRNA序列，根据序列，根据mRNAmRNA序列设计相应的核苷酸探针序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库，也可进行或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库，也可进行PCRPCR扩增。扩增。2 2、功能克隆、功能克隆第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理（1 1）消减杂交法）消减杂交法（2 2）DNA D
13、NA 标签法标签法（3 3）差别显示技术）差别显示技术包括：包括：mRNA mRNA 差别显示法等。差别显示法等。 （4 4）缺陷互补和反义）缺陷互补和反义mRNAmRNA技术技术（5 5）cDNAcDNA微阵列和基因芯片技术微阵列和基因芯片技术4、表型差异克隆表型差异克隆v利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因。利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因。 利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因，如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质隆基因，如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因
14、。相互作用的蛋白质的编码基因。5、染色体大片段基因克隆、染色体大片段基因克隆第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理是将带有目的基因的外源是将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。分子。（五）体外重组（五）体外重组 理想的运载理想的运载体是质粒，当给体是质粒，当给它安装一段外来它安装一段外来 DNADNA片段后，它片段后，它依然如故地进行依然如故地进行自我复制。自我复制。（六）载体构建（六）载体构建第一节第一节 基因工程操作原理基
15、因工程操作原理（1）农杆菌介导转化）农杆菌介导转化法：法：将外植体放入农杆将外植体放入农杆菌菌液中浸泡，然后转菌菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后组织和抗性芽，生根后的抗性植株移栽至营养的抗性植株移栽至营养钵培养。钵培养。（七）转化（七）转化1、植物转基因技术、植物转基因技术第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理又称又称微弹轰击法微弹轰击法。其。其基本原理基本原理是将外源是将外源DNADNA包被包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞
16、或组织，微粒上下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源的外源DNADNA进入细胞后，整合到植物染色体上，进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化，得到表达，从而实现基因的转化，（2）基因枪法）基因枪法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理 利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNADNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。（3）花粉管通道法）花粉管通道法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理8080年代初期周光宇年代初期周光宇转基因抗虫棉转基因抗虫棉不依赖组织培养不依赖组织培养首先制备植首先制备植物原生质体，游物原生质体，游离出细胞，在倒离出细胞，在倒置显微镜和显微置显微镜和显微操作器的帮助下，操作器的帮助下，将目的基因将目的基因DNA通过微管注射到通过微管注射到受体细胞中。受体细胞中。（4）微注射法）微注射法第一节第一节 基因工程
